雙向電泳分離水稻葉片蛋白實驗教學的探索

王琳 陸添宇 楊曉勤 王夢芝

[摘 要] 采用雙向電泳法分離水稻葉片蛋白，比較和分析了考馬斯亮藍染色方法和硝酸銀染色方法對掃描得到的雙向電泳圖譜的影響。通過改進水稻葉片蛋白的雙向電泳分離方法，可以得到更清晰的雙向電泳圖譜。結果表明，改進后的硝酸銀染色方法靈敏度更高，分離蛋白點更多且清晰。由此可知，改進的實驗方法可以得到更為靈敏、清晰的雙向電泳圖譜，能更好地適應和促進雙向電泳分離水稻葉片蛋白的實驗教學工作。

[關鍵詞] 實驗教學;改進;雙向電泳;葉片蛋白;水稻

[基金項目] 2018年度揚州大學動物科學專業國際化高水平人才研本一體化培養機制研究與構建（YZUJX2018—1A）

[作者簡介] 王 琳（1978—），女，江蘇徐州人，博士，揚州大學生物科學與技術學院講師，主要從事植物逆境生理與分子生物學研究;王夢芝（1972—），女，江蘇徐州人，博士，揚州大學動物科學與技術學院教授（通信作者），主要從事動物營養與飼料科學研究。

[中圖分類號] G642.0? ?[文獻標識碼] A? ?[文章編號] 1674-9324（2021）51-0029-04? ? [收稿日期] 2021-05-16

對于來自全細胞、組織或生物體中包含幾千種蛋白質的蛋白混合物的分離、檢測和分析是蛋白質組分析的首要目標。1975年O’Farrel首先建立了等電聚焦/SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（IEF/SDS-PAGE）分離和分析蛋白質組分的技術。這一技術應用兩種不同的分離原理，依據蛋白質的特性進行分離。第一種是依據蛋白質所帶電荷量的不同，用等電點（PI）聚焦技術分離蛋白質;第二種是依據蛋白質分子量大小的差別，通過蛋白質與SDS形成復合物后，在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移率的不同達到分離蛋白質的目的。雙向電泳技術，特別是以固相pH梯度等電聚焦為第一向的雙向電泳技術是當前分辨率最高且信息量最大的電泳技術。利用雙向凝膠電泳可以對不同樣品或同一細胞的不同狀態的蛋白質表達圖譜進行對比和分析。配合分析軟件如PDQuest、Image Master 2D等，找出蛋白質表達量上的差異。同時，雙向凝膠電泳的分辨率比較高，在應用固相pH梯度干膠條和窄pH梯度范圍膠條等技術后，能夠在一張凝膠上同時分離出幾千個甚至上萬個蛋白質點[1，2]。雙向電泳具有結果直觀、分辨率較高、信息量大、技術成熟等優點，因此該實驗成為本科生生物化學實驗中的基礎性實驗，是生物化學實驗教學的重要內容。

在雙向電泳中，為了獲得分辨效果好和重復性好的雙向電泳圖譜，得到質量高的水稻葉片蛋白電泳分離效果，找出合適的染色方法很重要。筆者在使用傳統的雙向電泳分離水稻葉片蛋白實驗[3，4]方法時發現，根據原來的染色方法分離的蛋白斑點較少且模糊。為了提高水稻葉片蛋白的雙向電泳分離效果，本文對此進行了探討。

一、實驗材料與方法

（一）實驗材料

本實驗所用水稻秈稻93-11稻種為揚州大學農學院提供。

1.材料種植與取樣。從5月中旬開始分期浸種，每期間隔10天，共7期，浸種時間為50～60小時，然后于烘箱中恒溫33℃進行催芽2～3天，將已催好芽的種子置于室內常溫下，時間為1天，然后將種子播于已做好的秧板中，約45天后將其移栽入塑料盆缽中，盆深65cm，盆底內徑55cm，盆口內徑65cm。每個品種10盆，每盆5穴，于正常條件下生長。定期施肥，并做好防蟲防病和除草工作。在取樣過程中，葉片保存在冰盒中，然后將葉片于液氮中進行固定，固定1天后取出葉片，放置于-80℃的冰箱中保存。

2.儀器。IPGphor電泳系統為Pharmacia公司的產品;Protein II垂直平板電泳槽、循環水浴箱為Bio-Rad公司的產品;清華紫光掃描儀為清華紫光總公司的產品;PDQUEST 7.2 2-D膠分析軟件為Bio-Rad公司的產品;U-2000型紫外-可見分光光度計為日本HITACHI公司的產品;冷凍干燥離心機speedvac為Applied Biosystem公司的產品。

3.試劑。固相pH梯度干膠條（pH3-10 L，180mm×3mm×0.5mm ，以及pH3-10 L，235mm×3mm×0.5mm）、載體兩性電解質（pH3-10）、IPG緩沖液、過硫酸銨、PMSF、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍R-250染料等產品購自Pharmacia公司;丙烯酰胺、N，N’-亞甲基丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、尿素、甘油、丙基磺酸鹽（CHAPS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸等為Amersco公司的產品;二硫蘇糖醇（DTT）、牛血清白蛋白（BSA）、蛋白質組級-胰蛋白酶、鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]、碘乙酰胺（ICH2CONH2）、三氟乙酸（TFA）、碳酸氫銨（NH4HCO3）、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）為Sigma公司的產品;四甲基乙二胺（TEMED）為SERVA公司的產品;低分子量標準蛋白質為上海伯奧生物制品公司的產品;冰乙酸、甲醇、乙腈（ACN）為國產分析純和國產色譜純;雙蒸水由本實驗室提供。

（二）方法

1.水稻葉片蛋白質提取。將保存在超低溫冰箱中的葉片取出，取適量放入研缽中，于液氮中研磨至葉片成粉末狀;放入50ml的離心管中，將樣品按1∶3的比例加入溶液A（10%三氯乙酸〔TCA〕和0.07%β-巰基乙醇的預冷丙酮溶液），充分振蕩，在-20℃下靜置過夜，然后4℃，11000rpm離心20分鐘，棄去上清，再加入溶液B（含0.07%β-巰基乙醇的冰預冷丙酮溶液）懸浮沉淀，充分振蕩后，在-20℃下沉淀1小時，然后4℃，11000rpm離心15分鐘，棄上清，重復兩次，將最終得到的沉淀物真空冷凍干燥，干燥后的樣品保存在-80℃的冰箱中備用。

2.蛋白質含量測定。蛋白質含量測定采用Bradford法：Bradford染色液為100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml的95%乙醇，加入100ml、85%（m/v）的磷酸，用水稀釋至1000ml配制而成。試劑的最終濃度為0.01%考馬斯亮藍G-250，4.7%（m/v）和8.5%（m/v）的磷酸。染色液用濾紙過濾，保存于室溫棕色瓶中，可使用數周，每次使用前先過濾。將BSA配制成濃度1mg/ml的溶液，取8支10ml的試管，1～6號試管分別加入10μl、20μl、30μl、40μl、50μl、60μl標準蛋白質溶液，不足60μl的用水補足至60μl，7號試管中加入60μl的蒸餾水，8號試管中加入蛋白質樣品溶液6μl，用水補足至60μl，加入3ml的Bradford染色液，充分振蕩混合，2分鐘后于595nm測定光的吸收值，測定在1小時內完成。利用不同濃度BSA的蛋白質濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線，根據所測蛋白質樣品的光吸收值算出1、2、3蛋白質樣品的預處理。

分別稱取一定量的水稻葉片凍干樣品，溶于裂解液中（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，2%IPG buffer 4-7，1%DTT），樣品超聲波處理5次，每次3～5秒，間隔3秒，于冰水中裂解30分鐘，14000rpm離心20分鐘，取上清，再離心，取上清，以充分去除雜質，獲得的蛋白樣品除了少量用作濃度測定外，其余進行分裝，于-80℃保存。每次用之前，將分裝的蛋白樣品取出，在室溫下解凍，根據所需總的蛋白質質量取一定體積的蛋白樣品，分別加入相應的水化液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，2%CHAPS，0.4%DTT，0.5%IPG buffer pH4-7或pH3-10），終體積為350μl，再加入微量溴酚藍振蕩混勻，2000rpm離心1分鐘，將含樣品的水化液均勻地加到水化盤中。

3.電泳。（1）第一向固相pH梯度等電聚焦。第一向等電聚焦基本是按照雙向電泳手冊上的方法進行。取pH3-10L或pH4-7L，18cm干膠條，去掉保護膜，準備水化。把干膠條膠面朝下置于水化盤中水化，加入IPG覆蓋液使整個IPG strip被覆蓋。水化時間為10～12小時，溫度20℃。取出水化好的膠條，膠面朝上置于持膠槽中，膠條正負極與持膠槽正負極要一致，并使膠條與持膠槽兩端電極充分接觸，加適量IPG覆蓋液覆蓋整個IPG strip。樣品液有兩種加入方式：水化前把樣品液加入水化液中和水化完畢后再在膠條槽加樣杯中加入樣品液，我們一般采用前一種方式。等電聚焦結束后，取出膠條，加入平衡液A（6mol/L尿素，0.05mol/L Tris-HCI，2%SDS，30%甘油，0.1%DTT，0.002%溴酚藍）振蕩平衡15分鐘，再換平衡液B（6mol/L尿素，0.5mol/L Tris-HCl，2%SDS，30%甘油，0.4%碘乙酰胺，0.002%溴酚藍）振蕩平衡15分鐘，取出膠條輕輕潤洗，并去除多余的平衡液，準備第二向電泳。（2）第二向電泳SDS-PAGE。第二向SDS-PAGE基本是按照雙向電泳手冊上的方法進行。采用分離膠濃度為12.5%的連續SDS-PAGE垂直平板電泳。將已平衡好的第一向膠條置于第二向凝膠的上方，排除氣泡，使二者緊密接觸。用1%的瓊脂糖凝膠封固膠條，接通電源，以15℃循環水浴冷卻。15mA/塊膠恒流電泳30分鐘，待溴酚藍前沿移至分離膠中后，再增大電流至30mA/塊膠，待溴酚藍前沿距凝膠板底0.5～1cm處，終止電泳，剝膠后準備染色。（3）凝膠染色（常規考馬斯亮藍R-250染色）。電泳結束后，將凝膠浸泡在固定液中過夜，然后在CBB R-250染色液中染色3～4小時，用蒸餾水漂洗數次，再用脫色液脫色，中間更換脫色液2～3次，至背景顏色淺淡，蛋白質斑點清晰即可。或者用蒸餾水漂洗數次后，用煮沸的蒸餾水脫色至背景顏色淺淡，蛋白質斑點清晰。（4）膠的掃描和保存。掃描儀掃描膠圖后，如果短暫保存，可以將膠放在終止液中，也可將凝膠從終止液中取出，用蒸餾水洗3次，每次5～10分鐘，然后放入密封帶，加1%的乙酸，在4℃下可保存數月。

（三）實驗方法的改進

首先采用三氯乙酸—丙酮法提取水稻葉片蛋白，其次用Bradford法測定蛋白質的含量，最后通過雙向分離水稻葉片蛋白進行第一向等電聚焦后，再進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。具體方法參照文獻[5]等。

電泳結束后，凝膠改用硝酸銀染色方法染色。將凝膠浸泡于固定液（40%無水乙醇，10%冰乙酸）中固定30分鐘或過夜，倒去固定液，換敏化液（30%無水乙醇，0.2%硫代硫酸鈉，6.8%的乙酸鈉）敏化30分鐘，倒去敏化液，以雙蒸水洗3次，每次5分鐘，然后置于銀染液（0.25%硝酸銀）中染色20分鐘，再次用雙蒸水洗2次，每次1分鐘，接著置于顯色液（2.5%無水碳酸鈉，0.04%甲醛）中至蛋白質斑點完全顯現為止，倒去顯色液，立即換終止液（1.5%乙二胺四乙酸二鈉）停止顯色，l0分鐘后用雙蒸水洗滌3次，每次5分鐘，此時凝膠就可以進行掃描和分析了。

二、結果與分析

在雙向電泳中，采用合適的染色方法可以得到令人滿意的雙向電泳圖譜，提高重復性，并有利于后續的進一步分析。我們試驗了2種常用于2-DE中的染色方法以比較其靈敏度。

從圖1可以看出在2種染色方法中，硝酸銀染色法靈敏度最高，可以觀察到許多低峰度蛋白質斑點，傳統考馬斯亮藍R-250染色法靈敏度最低，大多數低峰度蛋白質斑點無法顯現。從圖2可以看出相應位置的蛋白質斑點在采用硝酸銀染色法的膠中最清晰。

三、討論

染色方法對雙向電泳圖譜的清晰度有很大的影響。好的染色方法可以得到令人滿意的雙向電泳圖譜，提高重復性，并有利于進一步分析。不好的染色方法會造成圖譜不清晰、蛋白質斑點稀少等問題[6]。在本實驗教學中，改進的染色方法更有利于獲得蛋白數量多、背景清楚、靈敏度高的凝膠圖像，更適合雙向電泳分離水稻葉片蛋白的實驗教學。

四、結語

本實驗方法克服了雙向電泳分離水稻葉片蛋白傳統方法的不足，用硝酸銀染色方法代替原來的考馬斯亮藍法，得到了更為靈敏、清晰的實驗結果，促進了本科生的實驗教學工作，同時有利于其他教師從中得到啟發。

參考文獻

[1]索慧英，鄭密，盧晗，等.楊樹葉片蛋白質雙向電泳圖譜的建立[J].林業科學研究，2020，33（2）：128-137.

[2]王小蓓，王秀靜，李麗霞.潮間帶大型海藻小珊瑚藻蛋白質提取方法及雙向電泳體系優化[J].江蘇農業科學，2020，48（9）：72-77.

[3]郭堯君.蛋白質電泳實驗技術[M].2版.北京：科學出版社，2005：7-8.

[4]梁宋平.生物化學與分子生物學實驗教程[M].北京：高等教育出版社，2003：21-22.

[5]王琳，范云峰，粱建生.雙向電泳中不同樣品裂解液對水稻葉片疏水蛋白溶解效果比較[J].江蘇農業科學，2017，45（18）：54-56.

[6]沙偉，李雯煜，張麗麗，等.砂蘚總蛋白質提取方法的選取及雙向電泳體系的建立[J].基因組學與應用生物學，2020，39（6）：2659-2665.

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