基于TLR4/NF-κB分析“金汁”糞菌移植干預潰瘍性結腸炎小鼠的機制

吳成成 羅文兵 肖慧榮 謝昌營 胡麗霞 崔曼曼 張磊昌

【摘要】 目的：基于TLR4/NF-κB探討“金汁”糞菌移植（FMT）干預潰瘍性結腸炎（UC）小鼠的機制。方法：選取29只野生型雄性清潔級C57BL/10小鼠為研究對象。隨機選取7只作為對照組，其余22只大鼠采用葡聚糖酸鈉誘導法建立野生型小鼠UC模型。將這22只大鼠分為造模對照組（n=12）和FMT干預組（n=10），分別給予PBS液、糞菌液灌腸干預處理。另選取5只野生型雄性清潔級C57BL/10小鼠作為糞菌移植供體來源。觀察三組小鼠結腸組織TLR4、NF-κB（p65）表達水平，觀察三組小鼠結腸組織中下游細胞因子表達水平，分析TLR4、NF-κB（p65）及下游各細胞因子水平與疾病活動指數（DAI）和組織病理評分（HPS）的關系。結果：干預前，對照組DAI低于造模對照組和FMT干預組（P<0.05），造模對照組與FMT干預組DAI比較，差異無統計學意義（P>0.05）。干預后，造模對照組DAI高于對照組和FMT干預組，FMT干預組高于對照組（P<0.05）。FMT干預組干預后DAI低于干預前（P<0.05）。造模對照組HPS高于對照組與FMT干預組，且FMT干預組高于對照組（P<0.05）。造模對照組結腸長度短于FMT干預組與對照組，FMT干預組短于對照組（P<0.05）。造模對照組TLR4、NF-κB（p65）、TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8及Tfh均高于對照組和FMT干預組，FMT干預組均高于對照組（P<0.05）。FMT干預組Tfr水平高于造模對照組與對照組，造模對照組高于對照組（P<0.05）;造模對照組Tfh/Tfr水平高于對照組與FMT干預組，對照組高于FMT干預組（P<0.05）。TLR4、NF-κB（p65）、TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8、Tfh及Tfh/Tfr與DAI、HPS均呈正相關（P<0.05），Tfr與DAI、HPS均呈負相關（P<0.05）。結論：FMT可通過下調TLR4/NF-κB信號通路的表達，進而下調TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8、Tfh及Tfh/Tfr表達水平，達到改善UC的臨床癥狀。

【關鍵詞】 TLR4/NF-κB 潰瘍性結腸炎 糞菌移植

Based on TLR4/NF-κB Analyze the Mechanism of “Jinzhi” Fecal Microbiota Transplantation in Mice with Ulcerative Colitis/WU Chengcheng， LUO Wenbing， XIAO Huirong， XIE Changying， HU Lixia， CUI Manman， ZHANG Leichang. //Medical Innovation of China， 2021， 18（31）： 00-005

[Abstract] Objective： To investigate the mechanism of “Jinzhi” fecal microbiota transplantation （FMI） in mice with ulcerative colitis （UC） based on TLR4/NF-κB. Method： A total of 29 wild-type male clean grade C57BL/10 mice were selected as the research objects. 7 rats were randomly selected as the control group， and the other 22 rats were used to establish the wild-type mouse model of UC induced by dextran sulfate sodium. The 22 rats were divided into modeling control group （n=12） and FMT intervention group （n=10）， and were treated with PBS solution and faecal bacteria solution enema， respectively. Another 5 wild-type male C57BL/10 mice were selected as the donor source of faecal bacteria transplantation. The expression levels of TLR4 and NF-κB （p65） in colon tissues of mice in the three groups were observed， and the expression levels of cytokines in the middle and downstream of colon tissues of mice in the three groups were observed， and the relationship between TLR4， NF-κB （p65）， cytokines in the downstream and disease activity index （DAI） and hihiopathological score （HPS） was analyzed. Result： Before intervention， DAI in the control group was lower than those in the modeling control group and the FMT intervention group （P<0.05）， and there was no significant difference in DAI between the modeling control group and the FMT intervention group （P>0.05）. After intervention， DAI in modeling control group was higher than those of the control group and FMT intervention group， while FMT intervention group was higher than that of the control group （P<0.05）. DAI in FMT intervention group after intervention was lower than that before intervention （P<0.05）. The HPS of the modeling control group was higher than those of the control group and the FMT intervention group， and the FMT intervention group was higher than that of the control group （P<0.05）. The colon length of the modeling control group was shorter than those of the FMT intervention group and control group， and that of the FMT intervention group was shorter than that of the control group （P<0.05）. TLR4， NF-κB （p65）， TNF-α， IL-6， IL-1， IL-8 and Tfh in modeling control group were higher than those in control group and FMT intervention group， while those in FMT intervention group were higher than those in control group （P<0.05）. The Tfr level of FMT intervention group was higher than those of the modeling control group and control group， and that of the modeling control group was higher than that of the control group （P<0.05）. The level of Tfh/Tfr in modeling control group was higher than those in control group and FMT intervention group， and that in control group was higher than that in FMT intervention group （P<0.05）. TLR4， NF-κB（p65）， TNF-α， IL-6， IL-1， IL-8， Tfh and Tfh/Tfr were positively correlated with DAI and HPS （P<0.05）， while Tfr was negatively correlated with DAI and HPS （P<0.05）. Conclusion： FMT can improve the clinical symptoms of UC by down-regulating the expression of TLR4/NF-κB signaling pathway， and then down-regulating the expression levels of TNF-α， IL-6， IL-1， IL-8， Tfh and Tfh/Tfr.

[Key words] TLR4/NF-κB Ulcerative colitis Fecal microbiota transplantation

First-authors address： Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.31.001

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性炎癥性腸病，其病因和發病機制尚未完全明確，多數學者認為與環境、遺傳以及菌群失調等因素有關[1-2]。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）是啟動炎癥反應和免疫應答的重要受體，TLRs介導的信號轉導途徑中TLRs/NF-κB通路可調節腸黏膜中炎癥因子的表達水平，從而干預腸黏膜的炎癥反應[3]。糞菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是指通過健康人群的糞便提取功能菌群，再移植到患者消化道，重建腸道菌群的治療方式[4]。筆者的理論研究表明，中藥“金汁”與FMT乃源流之別，后者可視為對前者的繼承與創新，FMT乃是一種新“金汁”[5]。FMT在治療UC方面取得了一定的療效，筆者的前期動物實驗也證實了這一點[6]，但對于FMT治療炎性腸炎的具體機制仍不了解[7]。因此本文利用FMT干預對UC模型小鼠進行治療，基于TLR4/NF-κB信號通路探討FMT干預UC小鼠的作用機制，進一步為臨床利用“金汁”糞菌移植治療UC提供理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取29只野生型雄性清潔級C57BL/10小鼠為研究對象，周齡6～8周，平均體重（21.6±2.8）g，小鼠均由江西中醫藥大學實驗動物科技中心提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模方法 隨機選取7只作為對照組，其余22只大鼠采用葡聚糖酸鈉誘導法建立野生型小鼠潰瘍性結腸炎（UC）模型。將這22只大鼠隨機分為造模對照組（n=12）和糞菌移植（FMT）干預組（n=10），分別給予PBS液、糞菌液灌腸干預處理。另選取5只野生型雄性清潔級C57BL/10小鼠作為糞菌移植供體來源。給予造模小鼠5%葡聚糖硫酸鈉蒸餾水飲用飼養5 d，之后改為正常飲用水飼養10 d;反復進行上述操作3個循環后建立小鼠慢性UC模型。

1.2.2 糞菌液制作方法 取供體小鼠新鮮糞便標本，按7︰15（g/mL）溶于無菌PBS溶液中，分別采用2.0、1.0、0.5、0.25 mm不銹鋼篩過濾，過濾后離心機離心旋轉，6 000×g，離心15 min后取菌體，無菌PBS緩沖液沖洗3次，再重新置于25 mL PBS溶液中制成糞菌液，放置在4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3 干預方法 對照組給予正常飲用水和常規飼料喂養，不進行其他處理。造模對照組腹腔注射4%水合氯醛（10 μL/g）麻醉，將石蠟油涂于內徑2 mm塑料軟管上，并將軟管經小鼠肛門插入結腸，插入約4 cm，使小鼠倒立并緩慢注射0.2 mL PBS溶液，注射完畢后拔出軟管，棉球按壓小鼠肛門，使小鼠保持倒立1 min后放回籠中。灌腸頻率2次/d，持續2周。FMT干預組小鼠給予0.2 mL糞菌液灌腸，灌腸方式同造模對照組，灌腸頻率2次/d，持續2周。

1.2.4 TLR4、NF-κB（p65）表達水平檢測方法 采用頸椎脫臼法處死三組小鼠，U形切口剖開小鼠腹部，取出全部結腸組織。選擇適量結腸組織經10%甲醛溶液固定后石蠟切片，制作病理標本。采用免疫組化染色分析結腸組織TLR4、NF-κB（p65）表達水平。結腸組織石蠟包埋后進行4 μm厚連續切片，采用SABC法進行免疫組織化學染色。一抗：1︰100兔抗鼠NF-κB（p65）;二抗：生物素化山羊抗鼠IgG二抗工作液，均由武漢博士的生物科技有限公司提供。免疫后每張切片隨機選取5個視野，利用400倍光鏡進行攝片，通過Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統對結腸組織TLR4、NF-κB（p65）的表達情況進行定量分析。

1.2.5 細胞因子水平檢測方法 采用酶聯免疫吸附法（ELISA）對三組小鼠細胞因子水平進行檢測，具體操作按試劑盒說明書進行操作。

1.3 觀察指標及判定標準 （1）對比三組干預前后疾病活動指數（disease activity index，DAI）。采用人類炎性腸病疾病活動指數計算小鼠DAI，包括體重變化、大便性狀、便血程度三個方面，DAI=（體重下降分數+大便性狀分數+便血分數）/3[8]。（2）對比三組組織病理評分（histopathological score，HPS）及結腸長度。采用Delelman等[9]的評分方法評估小鼠HPS，包括炎癥程度、隱窩破壞、病變深度和病變范圍四個方面。（3）對比三組結腸組織TLR4、NF-κB（p65）表達水平及細胞因子表達水平。細胞因子包括腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-1（interleukin-1，IL-1）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）、脾臟組織濾泡輔助性T細胞（T follicular helper，Tfh）及濾泡調節性T細胞（T follicular regulatory，Tfr）水平。（4）分析TLR4、NF-κB（p65）以及各細胞因子水平與DAI與HPS的相關性。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗，多組間比較采用方差分析;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。采用Pearson進行相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組干預前后DAI對比 干預前后，三組DAI比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;干預前，對照組DAI低于造模對照組和FMT干預組（P<0.05），造模對照組與FMT干預組DAI比較，差異無統計學意義（P>0.05）。干預后，造模對照組DAI高于對照組和FMT干預組，FMT干預組高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。FMT干預組干預后DAI低于干預前（P<0.05），對照組與造模對照組干預前后DAI比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 三組HPS評分和結腸長度對比 造模對照組HPS高于對照組與FMT干預組，FMT干預組高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。造模對照組結腸長度短于FMT干預組與對照組，FMT干預組短于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 三組TLR4、NF-κB（p65）以及各細胞因子表達水平對比 造模對照組TLR4、NF-κB（p65）、TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8及Tfh均高于對照組和FMT干預組，FMT干預組均高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。FMT干預組Tfr水平高于造模對照組與對照組，造模對照組高于對照組（P<0.05）;造模對照組Tfh/Tfr水平高于對照組與FMT干預組，對照組高于FMT干預組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 TLR4、NF-κB（p65）以及各細胞因子與小鼠癥狀的關系 TLR4、NF-κB（p65）、TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8、Tfh及Tfh/Tfr與DAI、HPS均呈正相關，Tfr與DAI、HPS均呈負相關（P<0.05），見表4。

3 討論

UC屬于炎癥性腸炎，有學者提出UC的發病機制可能為環境因素導致易感人群在腸道菌群失調情況下，激活了腸道免疫和非免疫系統，引起腸道免疫反應，促進炎癥的發生和發展，最終形成UC[10-11]。腸道菌群是維持人體腸道免疫功能的重要角色，相對于人體來說是一種免疫機制。近年來越來越多學者轉向對腸道微生態的研究[12-14]?！敖鹬笔俏覈嗅t里的中藥之一，早在東晉時期《肘后備急方》中就有記載，明代的《本草綱目》中也有利用糞便治療疾病的記載[15]。糞菌移植是近年來興起的現代醫學治療方法，與中醫里的“金汁”有異曲同工之妙。張佳佳等[16]研究發現，FMT治療UC患者有效率高達90%。雖然FMT在治療UC上有著較好效果，但目前對FMT治療UC的作用機制仍未完全明確。

由于目前多數學者已經對TLRs介導的信號轉導途徑中TLRs/NF-κB通路調節腸黏膜炎癥因子的機制已經有較多研究，已證實TLR4、NF-κB的表達可上調或下調腸黏膜炎癥因子，而UC又屬于炎癥性腸炎，炎癥因子在UC的發生發展中起到重要作用[17-18]。因此本文通過糞菌移植治療UC模型小鼠，探討基于TLR4、NF-κB信號通路，FMT治療UC的作用機制。本文采用DAI、HPS來體現不同UC小鼠的癥狀程度，結果發現，對照組由于未建立UC模型，相對于造模對照組和FMT干預組，DAI、HPS均較低;FMT干預組經過FMT干預，DAI、HPS明顯降低，低于造模對照組;而造模對照組建立UC模型后，僅進行PBS緩沖液灌腸，并無治療作用，因此DAI、HPS最高。結果提示對照組未發生UC，FMT干預組小鼠UC病情有所緩解，而造模對照組小鼠未得到治療，UC病情嚴重。在對比三組小鼠結腸長度時發現，對照組最長，造模對照組最短，這是由于FMT干預組經過FMT治療，結腸腸黏膜得到修復改善，而造模對照組未治療，結腸腸黏膜損傷嚴重，長度明顯縮短。本研究發現，造模對照組TLR4、NF-κB（p65）以及上述下游細胞因子表達水平最高，FMT干預組其次，對照組最低。結果顯示，FMT干預組經過FMT干預能明顯降低TLR4、NF-κB（p65）和各細胞因子表達水平。在Di等[19]研究結果顯示，經過FMT干預的小鼠炎癥因子水平明顯低于未干預的小鼠，結果表明FMT能一定程度上抑制炎癥因子的合成和釋放，降低炎癥反應。本文研究結果與其結果一致。通過最終對比TLR4、NF-κB（p65）和各因子表達水平與三組小鼠的癥狀時發現，隨著小鼠UC程度越嚴重，TLR4、NF-κB（p65）和各因子表達水平越高，結果提示TLR4、NF-κB（p65）、TNF-α、IL-6、IL-1以及IL-8表達水平與UC癥狀呈明顯正相關。這表明TLR4、NF-κB（p65）、TNF-α、IL-6、IL-1以及IL-8參與了UC的發生和發展，TLR4、NF-κB（p65）、TNF-α、IL-6、IL-1以及IL-8表達水平提高，導致UC更嚴重。而經過FMT干預，能有效下調TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1以及IL-8的表達水平，這表明FMT是通過控制TLR4、NF-κB（p65）信號通路，來下調TNF-α、IL-6、IL-1以及IL-8的表達水平，從而減輕腸道炎癥反應，緩解UC癥狀。

Tfh和Tfr是CD4+T淋巴細胞的新亞型，主要由淋巴濾泡細胞分化而成，對平衡機體免疫力具有重要作用。研究顯示，自身免疫性疾病與Tfh/Tfr比例失衡具有重要關系[20]。在本文結果中發現，造模對照組Tfh和Tfh/Tfr均明顯高于對照組和FMT干預組（P<0.05），表明兩者可能參與了UC的發病過程。Tfh具有幫助B細胞發育的功效，能提高抗原親和力，維持長期體液免疫應答。Tfr是從調節性T細胞分化而來，具有趨化受體CXCR5的作用，抑制B細胞的分化和成熟，生成抗體等。結果顯示，造模對照組的Tfh和Tfr水平均高于對照組（P<0.05），且Tfh升高更明顯，因此Tfh/Tfr明顯升高。可見造模對照組發生了抗原抗體免疫反應，Tfh和Tfr均被刺激分化，以Tfh升高為主，進一步促進免疫應答。FMT干預組Tfh及Tfh/Tfr水平較造模對照組有明顯降低（P<0.05），表明接受糞菌移植后，小鼠上述指標有明顯下降，而Tfr水平升高，可見Tfh具有促進炎癥因子的作用，而Tfr是UC的保護因子。

綜上所述，糞菌移植可通過控制TLR4、NF-κB信號通路的表達，下調TNF-α、IL-6、IL-1、IL-8、Tfh及Tfh/Tfr表達水平，達到改善UC的臨床癥狀。

參考文獻

[1]王鄭君.糞菌移植在炎癥性腸病中的研究進展[J].醫學研究生學報，2019，32（8）：891-896.

[2]孫中美，李軍祥，趙興杰，等.清腸溫中方聯合糞菌移植對DSS誘導的潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜的保護作用及其機制研究[J].中國中醫急癥，2019，28（7）：1221-1225.

[3]劉鑫，閔敏，劉巖，等.糞菌移植治療潰瘍性結腸炎的臨床進展[J].中國醫刊，2017，52（1）：23-26.

[4]郭悅承，黃春蘭，陸穎影，等.糞菌移植治療現狀及其在炎癥性腸病中的應用[J].國際消化病雜志，2018，38（5）：294-296，305.

[5]劉朋，胡曉陽，李帥，等.中藥金汁與糞菌移植的異同及臨床運用[J].江西中醫藥大學學報，2018，3（5）：109-112.

[6]張磊昌，鐘世彪，肖慧榮，等.糞菌移植對潰瘍性結腸炎小鼠的干預效果分析[J].結直腸肛門外科，2017，23（6）：683-687.

[7] Ali A A，Abd Al Haleem E N，Khaleel S A，et al.Protective effect of cardamonin against acetic acid-induced ulcerative colitis in rats[J].Pharmacol Rep，2017，69（2）：268-275.

[8]林麗萍，王承黨.糞菌移植對潰瘍性結腸炎小鼠結腸黏膜Th1/Th2細胞及其細胞因子表達的影響[J].中國微生態學雜志，2017，29（12）：1365-1372.

[9] Dieleman L A，Palmen M J，Akol H，et al.Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium （DSS） is characterized by Th1 and Th2 cytokines[J].Clin Exp Immunol，1998，114（3）：385-391.

[10]胡慶，呂沐瀚，鄧明明，等.糞菌移植及聯合果膠治療對DSS誘導結腸炎小鼠的影響[J].西南醫科大學學報，2017，40（6）：577-582.

[11] Alatab S，Sepanlou S，Ikuta K S，et al.The global，regional，and national burden of inflammatory bowel disease in 195 countries and territories，1990-2017：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J].Lancet Gastroenterol Hepatol，2020，5（1）：17-30.

[12]張夢輝，王宏剛，王寒，等.腸道炎癥負擔程度評分對潰瘍性結腸炎炎癥負擔評價的研究[J].中國醫學裝備，2020，17（1）：122-125.

[13]倪小冬，李幼生，張永良，等.PEC途徑行糞菌移植加腸內營養治療復發性潰瘍性結腸炎[J].腸外與腸內營養，2015，22（1）：29-33，38.

[14]秦謙，龔豪，楊洋，等.糞菌移植通過改善腸黏膜屏障功能治療硫酸葡聚糖誘導的小鼠結腸炎[J].第三軍醫大學學報，2017，39（12）：1231-1238.

[15]祝青青，靖大道.糞菌移植療法在炎癥性腸病中的研究現狀[J].國際消化病雜志，2016，36（4）：224-226，230.

[16]張佳佳，王曉紅，王冰心，等.糞菌移植治療潰瘍性結腸炎的療效及其相關因素分析[J].胃腸病學，2019，24（3）：153-159.

[17]姬盼盼，周中銀，李櫆，等.糞菌移植在小鼠實驗性結腸炎中的療效研究[J].醫學研究雜志，2016，45（2）：54-58.

[18]卿蕊，向晴可，肖非，等.肺炎克雷伯菌黏附素FimH蛋白通過TLR4/NF-κB途徑誘導巨噬細胞分泌炎癥因子[J].免疫學雜志，2020，36（3）：208-212，218.

[19] Di Sabatino A，Santilli F，Guerci M，et al.Oxidative stress and thromboxane-dependent platelet activation in inflammatory bowel disease：effects of anti-TNF-αtreatment[J].Thromb Haemost，2016，116（3）：486-495.

[20] LIU G，YU L，FANG J，et al.Methionine restriction on oxidative stress and immune response in dss-induced colitis mice[J].Oncotarget，2017，8（27）：44511-44520.

（收稿日期：2021-02-18） （本文編輯：田婧）