大口黑鱸源遲緩愛德華氏菌的分離鑒定及藥敏試驗*

彭鐘琴，黃 璐

（廣東茂名農(nóng)林科技職業(yè)學(xué)院，廣東 茂名 525000）

大口黑鱸（Micropterus salmoides），別名加州鱸、黑鱸，隸屬于魚綱、鱸形目、鱸亞目，棘臀鱸科、黑鱸屬，原產(chǎn)于美國加利福尼亞，在英國、法國、南非、巴西、菲律賓、中國等國家有引種繁殖，1984年引入我國廣東，后推廣養(yǎng)殖，為純淡水魚類，肉食性，人工養(yǎng)殖攝食配合飼料，生長快、肉質(zhì)細嫩，味美，有“淡水石斑”之稱[1]。

遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda，Et）又稱為遲鈍愛德華氏菌或緩慢愛德華氏菌，屬于腸桿菌科的愛德華菌屬（Edwardsiella），革蘭氏陰性短桿菌，可運動[2]。遲緩愛德華氏菌可引起魚類、鳥類、爬行類和人類感染患病，是一種人-魚共患的條件致病菌。1962年從日本鰻魚體內(nèi)首次分離得到遲緩愛德華氏菌，我國最早關(guān)于遲緩愛德華氏菌感染的案例發(fā)現(xiàn)于1989年在福建某養(yǎng)殖鰻鱺中，隨后在多種養(yǎng)殖魚類中檢測到該菌，引起羅非魚、胡子鲇、黃顙魚、牙鲆等經(jīng)濟魚類大量死亡，對養(yǎng)殖戶造成巨大損失，該病原菌已嚴重危害我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

患病大口黑鱸采自廣東省佛山市某養(yǎng)殖場，病魚的主要癥狀為食欲下降，游動無力，反應(yīng)遲鈍，生殖孔發(fā)紅，腹部膨大，在感染后期產(chǎn)生了“頭穿孔”的現(xiàn)象。人工感染用大口黑鱸來源于廣東省佛山市某養(yǎng)殖場。

主要試劑：革蘭氏染色試劑盒、藥敏紙片、Super Mix、核酸染料、DNA Maker DL2000、瓊脂糖粉、細菌DNA提取試劑盒、營養(yǎng)肉湯營養(yǎng)和瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 病原菌分離純化

采用無菌操作，從患病大口黑鱸的肝臟、腎臟、腹水中取樣并接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，在28℃下培養(yǎng)24h，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢單個菌落進行純培養(yǎng)得到一株優(yōu)勢菌株SD1010。

1.3 病原菌理化特性鑒定

分離菌株接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，在28℃下培養(yǎng)24 h，觀察菌落的形態(tài)特征。取純化菌落加入無菌生理鹽水制成抹片經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，觀察菌體形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及染色特性。將菌株SD1010接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，向各微量生化鑒定管加入80 μL菌液，在28℃培養(yǎng)24 h后根據(jù)反應(yīng)現(xiàn)象進行生理生化鑒定。

1.4 病原菌16S rRNA基因序列分析

1.4.1 菌株全基因組提取

將菌株SD1010接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，28℃下恒溫震蕩培養(yǎng)18 h，離心收集菌液1 mL，按照DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取。

1.4.2 菌株SD1010的16S rRNA PCR測序

按照表1，進行16S rRNA PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，寄送上海生工生物工程有限公司純化并測序。

表1 引物序列及PCR擴增反應(yīng)條件

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測序得到菌株SD1010的16S rRNA序列在NCBI上進行BLAST比對，利用MEGA11.0軟件進行多重序列比對分析，采用鄰接法（Neighbor Joining Method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 人工感染試驗

健康大口黑鱸于28℃下暫養(yǎng)一周，將70尾健康的大口黑鱸隨機分為7組（6組為試驗組，1組為對照組），每組10尾。將培養(yǎng)好的菌株SD1010用無菌生理鹽水制成菌懸液，調(diào)整菌懸液的濃度為1.8×108CFU/mL，稀釋成梯度為1.8×107CFU/mL、1.8×106CFU/mL、1.8×105CFU/mL、1.8×104CFU/mL、1.8×103CFU/mL，對試驗組每尾魚緩慢腹腔注射0.1 mL菌懸液，對照組魚則注射0.1 mL生理鹽水。對其進行常規(guī)管理，隨時觀察。分離菌株的致病性根據(jù)各組魚的病死數(shù)和剖檢病變程度來確定，依據(jù)寇氏法計算半致死劑量（LD50）。

1.6 藥敏試驗

采用K-B紙片擴散法，無菌條件下取100 μL純化細菌培養(yǎng)18 h的菌液制成1.0×108CFU/mL菌懸液，用涂布棒均勻涂抹在瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌鑷子將抗生素藥敏紙片均勻地貼在距離培養(yǎng)皿邊緣15 mm處的菌液培養(yǎng)皿表面，倒置在28℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑大小，根據(jù)美國臨床實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI）的抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準，判定藥敏結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

從病魚肝臟中分離得到一株優(yōu)勢菌株SD1010，該菌株菌落邊緣整齊、灰白色、濕潤、表面光滑，桿狀，革蘭氏染色陰性。

2.2 生理生化特性鑒定結(jié)果

表2 菌株SD1010的生理生化特性

2.3 16S rRNA基因序列分析結(jié)果

菌株SD1010的16S rRNA基因測序結(jié)果為1 431 bp，將得到的序列在NCBI上進行BLAST分析，結(jié)果顯示，菌株SD1010測序序列與Gen Bank中遲緩愛德華氏菌基因序列的16S rRNA序列同源性為98.00%；構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，菌株SD1010與遲緩愛德華氏菌聚為一類。根據(jù)菌株SD1010的細菌特征、生化鑒定特性及其16S rRNA序列分析可知，菌株SD1010為遲緩愛德華氏菌（圖1）。

圖1 菌株SD1010的16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 人工感染試驗結(jié)果

人工感染后，發(fā)病大口黑鱸的主要癥狀與自然感染菌株SD1010的大口黑鱸癥狀相似（圖2），對照組無發(fā)病癥狀和死亡現(xiàn)象。根據(jù)寇氏法計算可得菌株SD1010對雜交鱧的半致死劑量為1.43×105CFU/g（表3）。

圖2 大口黑鱸攻毒病癥圖

表3 人工感染結(jié)果

2.5 藥敏實驗結(jié)果

藥敏結(jié)果顯示（表4），菌株SD1010對多粘菌素B、萬古霉素、多西環(huán)素、丁胺卡那、頭孢哌酮、頭孢呋辛、頭孢拉定、氟苯尼考高度敏感，對紅霉素、新霉素、氨芐西林、苯唑西林、利福平中度敏感，而對克林霉素、氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、青霉素、磺胺異惡唑耐藥。

表4 菌株SD1010的藥敏試驗結(jié)果

3 討論

遲緩愛德華氏菌由日本科學(xué)家于1962年從患病鰻鱺體內(nèi)進行病原分離時首次發(fā)現(xiàn)，該病原菌常見于水產(chǎn)動物，相繼有羅非魚、黃顙魚、斑點叉尾鮰、南方鲇、鯽魚、鰱魚、鯪魚、鱖魚、大菱鲆、牙鲆、日本鰻鱺、鱘魚等水產(chǎn)動物感染遲緩愛德華氏菌的報道，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害極大，本研究從大口黑鱸病例中分離到遲緩愛德華氏菌在國內(nèi)尚屬首次。

遲緩愛德華氏菌感染魚類的典型癥狀為肛門紅腫、腹腔內(nèi)有大量腹水，但腸道無腹水，肝腎腫大并伴有出血，頭部發(fā)紅，有的魚類出現(xiàn)“裂頭”[4]。本研究對象大口黑鱸則食欲下降，生殖孔發(fā)紅，肝腎腫大出血，腹部膨大，在感染后期產(chǎn)生了“頭穿孔”的現(xiàn)象，繼而在發(fā)病一段時間后引起大規(guī)模死亡，與遲緩愛德華氏菌致病癥狀類似。因遲緩愛德華氏菌傳播機制尚未明確，主要通過魚類的消化道、鰓或受傷的表皮侵入魚體，因此，保持良好的養(yǎng)殖條件可能是預(yù)防和控制該病害的更有效方法。

經(jīng)典的細菌分類鑒定是基于分離菌株的形態(tài)特征和生理生化特征，耗時長，過程復(fù)雜，準確度不好。目前，魚類細菌性疾病診斷常采用常規(guī)表型鑒定結(jié)合16S rRNA測序分析比對鑒定，病原菌鑒定更顯準確性[5]。本次研究從大口黑鱸病魚肝臟內(nèi)分離獲得一株純化細菌，在培養(yǎng)基生成圓形、光滑、濕潤、半透明的灰白色小菌落，革蘭氏染色為陰性，生理生化鑒定與遲緩愛德華氏菌標準菌株結(jié)果一致，16S rRNA PCR測序比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，菌株SD1010與遲緩愛德華氏菌16S rRNA聚為一族，與Gen Bank已公布的遲緩愛德華氏菌參考菌株的16S rRNA序列相似性在98.00%，以上鑒定為遲緩愛德華氏菌，鑒定結(jié)果良好。

本研究分離菌株SD1010對多粘菌素B、萬古霉素、多西環(huán)素、丁胺卡那、頭孢哌酮、頭孢呋辛、頭孢拉定、氟苯尼考高度敏感，對紅霉素、新霉素、氨芐西林、苯唑西林、利福平中度敏感，而對克林霉素、氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、青霉素、磺胺異惡唑耐藥。其中，紅霉素、氯霉素、青霉素等抗生素已被列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥。臨床上可選用多粘菌素B、萬古霉素、多西環(huán)素、丁胺卡那、頭孢哌酮、頭孢呋辛、頭孢拉定、氟苯尼考作為用藥參考[6]。

4 結(jié)束語

大口黑鱸感染遲緩愛德華氏菌后引發(fā)死亡，臨床上可選用多粘菌素B、萬古霉素、多西環(huán)素、丁胺卡那、頭孢哌酮、頭孢呋辛、頭孢拉定、氟苯尼考高度敏感藥物進行治療。