水稻籽粒厚度基因GT1的連鎖分析

李陛方

（蕉嶺縣長潭鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心，廣東 梅州 514185）

水稻是中國的第一大糧食作物，隨著我國人口的不斷增長，預(yù)計(jì)到2030年，我國糧食總量將要從2010年的5.8億噸增至7.4億噸方能滿足需要[1-2]，因此，提高水稻產(chǎn)量對(duì)我國的糧食安全具有重要的意義。

影響水稻產(chǎn)量最重要的因素之一是水稻的籽粒性狀，包括粒重、粒長、粒寬、粒厚和長寬比等，而且水稻籽粒性狀已成為水稻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)分子設(shè)計(jì)育種的重要靶標(biāo)性狀[3]。其中粒厚是水稻籽粒性狀的重要組成部分，是水稻重要的經(jīng)濟(jì)性狀。熊振民和孔繁林通過對(duì)秈稻的9個(gè)雜交組合進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)水稻的籽粒性狀中粒厚與粒重的關(guān)系最為密切，粒厚是受多基因控制的粒形性狀[4]。水稻粒厚性狀的遺傳機(jī)制較為復(fù)雜，同時(shí)國內(nèi)外學(xué)者對(duì)水稻粒厚性狀的遺傳研究報(bào)道也較為少見，因此有必要對(duì)水稻粒厚性狀進(jìn)行適當(dāng)?shù)难芯俊?/p>

經(jīng)多年觀察，水稻的粒厚性狀與巨胚性狀可能存在連鎖遺傳，本研究通過調(diào)查分析表現(xiàn)型為厚粒正常胚的水稻品種XHZ和表現(xiàn)型為薄粒巨胚的水稻品種JPHN兩親本雜交后代F2群體的田間表現(xiàn)，證明巨胚性狀與粒厚性狀的連鎖關(guān)系，然后利用巨胚基因GE附近的一些分子標(biāo)記引物對(duì)兩個(gè)親本進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選，嘗試對(duì)粒厚基因GT1作進(jìn)一步的定位分析。通過定位粒厚基因，尋找控制粒厚的關(guān)鍵基因，為今后開展進(jìn)一步的粒厚基因精細(xì)定位、克隆和功能分析，對(duì)闡明水稻籽粒性狀遺傳控制和產(chǎn)量形成的機(jī)理，具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

兩個(gè)水稻品種：XHZ和JPHN為親本材料。XHZ是水稻品種新黃占，該品種的籽粒為厚粒，胚為正常胚；JPHN是水稻品種巨胚黑糯，該品種的籽粒為薄粒，胚為巨胚。

1.2 方法

1.2.1 提取親本DNA進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選

預(yù)計(jì)巨胚性狀與粒厚性狀連鎖，在巨胚基因附近設(shè)計(jì)了9對(duì)分子標(biāo)記物在兩親本間進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選。9對(duì)分子標(biāo)記的引物序列以及片段大小見表1。

表1 用于兩親本間多態(tài)性篩選的分子標(biāo)記

1.2.2 提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增

提取兩個(gè)親本材料XHZ和JPHN的DNA，然后，使用適當(dāng)?shù)囊锓謩e對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。運(yùn)行反應(yīng)的程序?yàn)椋?5℃變性4 min，循環(huán)（95℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃適溫延伸 40 s），一共 40 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，最后 15℃保存[5]。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，觀察電泳圖譜的成像結(jié)果，拍照分析并保存。

1.2.4 田間種植

利用這兩個(gè)品種XHZ和JPHN進(jìn)行雜交得到其親本及F1代雜交種子。進(jìn)行篩選工作剔除假雜種，播種F2代種子，后進(jìn)行插秧工作，田間種植26行，以數(shù)字編號(hào)1～26，每行40株，以數(shù)字編號(hào)1～40，插秧時(shí)確保單本插秧。統(tǒng)一栽培管理，保持田間肥水一致，得到F2代群體約1 000株。水稻成熟時(shí)，在約1 000株系中每個(gè)株系隨機(jī)收獲3穗，自然晾干后進(jìn)行考種工作。

1.2.5 巨胚的觀察與統(tǒng)計(jì)

在每個(gè)樣本中，隨機(jī)選取5粒完整無損的稻谷，剝?nèi)サ練ぃ冻鐾旰玫牡久鬃蚜?，觀察胚的大小，記錄出現(xiàn)巨胚的樣本。

1.2.6 粒厚的測(cè)定

水稻籽粒厚度的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)參照《水稻種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[6]。實(shí)驗(yàn)方法：隨機(jī)數(shù)取完整無損的10粒稻谷，將稻谷肩并肩側(cè)豎于膠帶上，使其不傾斜，不留縫，測(cè)出厚度，每份材料重復(fù)測(cè)量2次，取其平均值即為粒厚。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件計(jì)算水稻粒厚的均值，統(tǒng)計(jì)F2群體中厚粒正常胚、薄粒巨胚、厚粒正常胚和厚粒巨胚四種表現(xiàn)型的樣本數(shù)目，觀察其頻率分布并計(jì)算重組率，判斷粒厚與巨胚之間是否存在連鎖。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本的表型分析

測(cè)量兩親本的粒厚，并觀察其胚型。兩親本的表型情況見表2。親本XHZ的粒厚性狀表現(xiàn)為厚粒，胚的性狀表現(xiàn)為正常胚；親本JPHN的粒厚性狀表現(xiàn)為薄粒，胚的性狀表現(xiàn)為巨胚。

表2 兩親本的表現(xiàn)型

2.2 巨胚與粒厚的連鎖分析

F2群體四種表現(xiàn)型的分離情況如表3所示。在F2群體中，厚粒正常胚和薄粒巨胚為親本型，薄粒正常胚和巨胚為重組型，根據(jù)重組率的計(jì)算公式：重組率（%）=（重組型個(gè)體數(shù)/測(cè)交子代的個(gè)體總數(shù)）×100%，可以計(jì)算出F2群體1～8、9～16、17～26及總?cè)后w1～26的重組率分別為25.60%、24.40%、28.50%和26.40%。因此，可以知道控制巨胚的基因與控制粒厚的基因存在連鎖關(guān)系。粒厚與巨胚兩個(gè)基因之間的重組率為26.40%，連鎖距離為26.40 cm。

表3 F2群體各表型的分離情況及重組率

2.3 親本間多態(tài)性標(biāo)記篩選

因?yàn)樗揪夼呋騁E與粒厚基因GT1是連鎖的，在巨胚基因GE附近找到這9對(duì)分子標(biāo)記引物：GT01、GT02、GT03、PSM353、RM505、PSM432、RM234、RM18 和RM47，對(duì)兩個(gè)親本XHZ和JPHN進(jìn)行多態(tài)性分子標(biāo)記篩選，結(jié)果顯示并未能利用這9對(duì)分子標(biāo)記引物篩選到兩者存在多態(tài)性，因此無法對(duì)粒厚基因進(jìn)行進(jìn)一步的定位分析。

3 結(jié)論

本研究對(duì)XHZ和JPHN兩個(gè)親本雜交后代F2群體四種表型，即厚粒正常胚、薄粒巨胚、薄粒正常胚和厚粒巨胚的分離情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，水稻籽粒厚度基因與巨胚基因是連鎖的，根據(jù)重組率計(jì)算公式可以計(jì)算出兩個(gè)基因之間的重組率為26.40%，連鎖距離為26.40 cm。

本研究通過統(tǒng)計(jì)分析XHZ和JPHN雜交后代F2四種表型的分離情況，驗(yàn)證了水稻巨胚基因與籽粒厚度基因的連鎖關(guān)系，然后利用了巨胚基因GE附近的9對(duì)分子 標(biāo) 記 引 物 ：GT01、GT02、GT03、PSM353、RM505、PSM432、RM234、RM18和RM47，試圖使用這些引物在兩個(gè)親本XHZ和JPHN之間進(jìn)行多態(tài)性分子標(biāo)記篩選，嘗試對(duì)水稻籽粒厚度基因作進(jìn)一步的基因定位。然而在實(shí)際操作中，未能成功地利用這9對(duì)分子標(biāo)記引物篩選出兩個(gè)親本的多態(tài)性，無法進(jìn)行下一步的粒厚基因定位。因此，今后應(yīng)使用更多的分子標(biāo)記引物去進(jìn)行它們的多態(tài)性分子標(biāo)記篩選，完成水稻籽粒厚度基因的定位分析。對(duì)粒厚基因進(jìn)行定位分析，可以幫助了解水稻產(chǎn)量性狀的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，同時(shí)也可以在生產(chǎn)實(shí)踐中提高水稻產(chǎn)量提供更多的利用途徑。隨著更多的水稻籽粒性狀相關(guān)基因的定位、QTL克隆和相關(guān)功能研究，將會(huì)更加了解水稻籽粒性狀控制的分子機(jī)制，掌握水稻產(chǎn)量性狀復(fù)雜的遺傳機(jī)理，為水稻高產(chǎn)分子育種提供相應(yīng)的理論依據(jù)，并在水稻分子育種的實(shí)踐中得到應(yīng)用。