超高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品16種獸藥殘留量的研究*

陳鑫

（福州市產品質量檢驗所，福建 福州 350025）

近年來，獸藥在養殖業、畜牧業中的應用日趨廣泛，但是，由于科學知識的缺乏和經濟利益的驅使，一些養殖戶在養殖過程中存在超劑量、違禁、不遵守休藥期等使用獸藥的問題，導致動物源性食品中獸藥殘留成為了日益突出的問題。目前，動物源性食品中常見有抗病毒類、磺胺類、喹諾酮類、抗生素類、激素類、鎮靜劑等獸藥殘留，由于動物源性食品種類繁多，樣品基質復雜，檢測目標物種類和組分多，理化性質差異大，是獸藥殘留分析檢測技術的重大難題。我國測定動物源性食品中獸藥殘留的國家標準[1～3]大部分都是分類檢測為主，一個樣本要進行多次檢驗，需要耗費極大的人為、物力、財力和時間。針對動物源性食品獸藥殘留檢驗任務繁重且時間緊迫的問題，研究快速、有效的分析檢測方法，提高提取和凈化效率，提高檢測靈敏度，建立高通量的多獸藥殘留分析方法是當前獸藥檢測研究的方向。

本研究依據國家食品安全監督抽檢實施細則（2020版）[4]動物源性食品中喹諾酮類、磺胺類限用獸藥監測項目，結合抗病毒類禁用藥物，建立同時檢測動物源性食品中抗病毒類、喹諾酮類、磺胺類（金剛烷胺、金剛乙胺、恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶）16種禁限用獸藥殘留的高效液相色譜－串聯質譜檢測方法，為提高禁限用獸藥殘留檢測效率，保障食品安全提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

雞肉、雞肝、豬肉和豬肝樣品均為市售。

1.1.2 試劑及耗材

標準品（金剛烷胺、金剛乙胺：ChromaDEX公司；恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶：農業部環科所）。

氘代內標（金剛烷胺D6、金剛乙胺D4 ：Cndisotopes公司；恩諾沙星D5、環丙沙星D8、諾氟沙星D5、磺胺間二甲氧嘧啶D6、磺胺鄰二甲氧嘧啶D3：農業部農產品質量標準研究中心）。

凈化填料（C18、PSA：安捷倫科技有限公司；NH2、Florisil：Agela科技有限公司）。

試劑（水為超純水；甲醇、乙腈、乙酸銨、無水硫酸鎂、無水硫酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 主要儀器

1290 超高效液相+6460A質譜儀：美國Agilent公司；

InertSustain C18 柱：2.1 mm×50 mm，2 μm，日本島津公司；

Eclipse XDB-C8 柱：2.1 mm×50 mm，1.8 μm，美國安捷倫科技有限公司；

KQ3200B 型超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司；

N-EVAP氮吹濃縮儀：美國Organomation公司； GENIUS 3 旋渦混合器：德國IKA公司；

TDL-5-A 低速臺式離心機：上海安亭電子儀器廠； AL204 電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相條件

色譜柱：C18色譜柱，2.1 mm（內徑）×50 mm，粒徑 2μm；流動相：A，含0.1%甲酸的水溶液，B，乙腈。

柱溫： 35 ℃；流速：0.2 mL/min；進樣量：1 μL。 梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序表

1.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧ESI，正離子模式；掃描方式：多反應監測MRM；霧化氣、輔助氣、碰撞氣均為高純氮氣。

使用前應調節各參數使質譜靈敏度達到檢測要求，監測離子對、碰撞能以及碎裂電壓等主要質譜參數見表2。

內標法定量，金剛烷胺以金剛烷胺D6為內標；金剛乙胺以金剛乙胺D4為內標；恩諾沙星以恩諾沙星D5為內標；環丙沙星以環丙沙星D8為內標；諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星以諾氟沙星D5為內標；磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉以磺胺間二甲氧嘧啶D6為內標；磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶以磺胺鄰二甲氧嘧啶D3為內標[2,3]。

1.4 標準溶液配制

標準溶液的配制：分別取適量標準品，用甲醇分別配制成10.0μg/mL的標準儲備液，避光-18 ℃下保存，有效期3個月。用甲醇將標準儲備液稀釋，配成磺胺類、氟喹諾酮類濃度為1.0μg/mL，抗病毒類濃度為0.1μg/mL的混合標準中間溶液，避光-18 ℃下保存，有效期1個月。

表2 目標化合物質譜參數

內標溶液的配制：分別取適量氘代內標，用甲醇分別配制成10.0μg/mL的標準貯備液，避光-18 ℃下保存，有效期3個月。用甲醇將內標儲備液稀釋，配成磺胺類、氟喹諾酮類濃度為1.0μg/mL，抗病毒類濃度為0.1 μg/mL的混合內標標準中間溶液，避光-18 ℃下保存，有效期1個月。

混合標準工作溶液：吸取適量的混合標準中間溶液和同位素內標中間溶液，用甲醇配制成磺胺類、氟喹諾酮類濃度為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL（混合同位素內標濃度為10.0 ng/mL)，抗病毒類濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL（混合同位素內標為1.0 ng/mL）的混合標準工作溶液，當天配制。

1.5 實驗方法

稱取約5.00 g（精確至0.01 g）的均勻試樣，置于50 mL塑料離心管中，準確加入混合內標工作液10μL，加入1 g氯化鈉，15 mL 1%甲酸-乙腈溶液（體積分數），渦旋混合30 s，超聲提取10 min，4000 r/min離心5 min，收集上清液。剩余部分重新加入15 mL 1%甲酸乙腈，重復提取1次，合并2次提取有機相，待凈化。

凈化：將提取液移入含有100 mg C18填料和500 mg 無水硫酸鈉的試管中，渦旋提取30 s，吸取所有有機相溶液，50 ℃氮吹濃縮至近干，加入1.0 mL0.1%甲酸-25%乙腈水，渦旋混合溶解殘渣， 0.22μm濾膜過濾后進行液相色譜串聯質譜測定[5,6]。

2 結果與分析

2.1 質譜和色譜條件的優化

圖1 色譜柱分離效果圖

對目標化合物的質譜及色譜條件進行了優化，目標化合物及其內標物的定量離子色譜圖及質譜參數結果見圖2和表2。比較了C18和C8色譜柱對目標物的分離效果，C8色譜柱對目標物的保留能力均較弱，峰形較寬，選用C18色譜柱作為分離色譜柱。比較了幾種不同流動相體系（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.01 mol/L乙酸銨、甲醇-0.01 mol/L乙酸銨），經比較發現，當水相中含有甲酸時，能夠明顯提高色譜分離的效果；使用乙腈為有機相時，各化合物的峰形和靈敏度效果優于甲醇，最終選用乙腈-0.1%甲酸水為流動相，液相色譜梯度洗脫程序如表1所示，標準物質色譜柱分離效果如圖1所示。

2.2 前處理條件的優化

本研究選擇豬肉作為實驗對象，分別用乙腈、1%甲酸-乙腈（體積分數）、1%乙酸-乙腈（體積分數）、1%氨水-乙腈（體積分數）4種提取溶液，通過添加回收實驗發現，1%甲酸-乙腈（體積分數）提取溶液的提取效果優于其它提取溶液，其回收率最好。因此，本研究選擇1%甲酸-乙腈體系作為提取溶液體系。

QuEChERs 凈化方法所使用的填料有PSA、C18、GCB、NH2和Florisil等，本研究首先考察了這幾種填料對目標化合物的凈化效果，分別在標準工作液中加入50 mg填料，結果表明， GCB、NH2、Florisil對氟喹諾酮類化合物及磺胺氯噠嗪有不同程度上的吸附，PSA對磺胺氯噠嗪有吸附，只有C18吸附劑不干擾目標化合物的響應值。進一步考察C18填料使用量，最終選擇C18 100 mg作為凈化吸附劑。

圖2 目標化合物定量離子提取色譜圖

圖2 目標化合物定量離子提取色譜圖（續）

2.3 定量方法選擇

基質效應影響主要是指基質在電離源霧化電離過程中對目標物的霧化電離產生抑制或增強作用[7]。通常，去除基質效應的方法是配制基質加標曲線，但由于檢測樣品種類繁多，難以找到匹配基質液。因此，本研究采用同位素內標法，通過內標定量，降低樣品處理過程中基質產生的影響。

分別考察了純標準物質線性、基質空白加標線性（將空白樣品按前處理方法提取凈化后，在提取液中添加目標化合物配制成系列標準曲線）、隨行加標線性（空白樣品，加入一定量的標準溶液，與樣品同時進行提取和凈化得到的線性），經比較發現：隨行加標線性由于在提取和凈化過程中造成了損失，得到的線性不夠理想；純標準物質線性、基質空白加標線性由于內標校正作用，其線性及對目標化合物的定量效果相當，考慮到基質空白加標線性配制過程繁瑣，因此，采用純標準物質線性進行定量，線性方程及相關系數見表3。

2.4 方法的檢出限、回收率和精密度

分別進行了豬肉、豬肝、雞肉和雞肝樣品的基質加標實驗，以3倍信噪比，進行檢出限的考察，綜合不同基質的復雜性，得出抗病毒類藥物金剛烷胺和金剛乙胺的最低檢測限均為0.5μg/kg，磺胺類和氟喹諾酮類藥物的最低檢測限為1.0μg/kg。采用添加回收的方法進行回收率實驗，添加了3個不同水平，每個試驗對象進行6次平行試驗，計算其標準偏差。通過表4和表5可知，本方法的回收率范圍為71.2%～119.6%，相對標準偏差范圍為1.8%～10%，能滿足獸藥殘留測定的要求。

表3 線性方程、相關系數

表4 抗病毒類藥物回收率和精密度

表5 磺胺類和氟喹諾酮類藥物回收率和精密度

圖3 陽性樣品色譜圖

2.5 樣品檢測

采用所建立的方法測定了購于超市及農副產品市場樣品，測定雞肉、雞肝、豬肉和豬肝樣品共計38份，所檢測樣品檢出2份恩諾沙星及1份氧氟沙星藥物殘留，陽性樣品色譜圖見圖3。

3 結論

本研究建立了動物源性食品中16種禁限用獸藥殘留的分析方法，通過優化液相色譜、質譜條件，考察樣品前處理方法，內標法定量，建立了動物源性食品中抗毒類、磺胺類和氟喹諾酮類16種獸藥殘留的液相色譜串聯質譜法測定方法。該方法操作簡單、快速、準確，克服單一種類獸藥殘留檢驗操作繁瑣的缺點，適用于多獸殘實際樣品的篩查和測定。