羅非魚羅湖病毒實時熒光RT-LAMP檢測方法的建立

劉助紅，張璜，唐玲，劉賢旭，林潔文，吳林

（1.廣東科貿職業學院，廣東 廣州 510430；2.廣州雙螺旋基因科技有限公司，廣東 廣州 510005；3.暨南大學，廣東 廣州 510632）

羅非魚（又名非洲鯽魚）蛋白質含量高、少刺而深受消費者喜愛，被世界糧農組織（FAO）稱作未來動物性蛋白質的主要來源[1-3]，是世界水產業重點研究和養殖的淡水魚類之一。與其他魚類相比，羅非魚抗病力強，更容易養殖，自引入我國后，羅非魚的養殖業得到了飛速發展，養殖產量逐年增長，目前已成為世界羅非魚生產大國和出口大國[4,5]。

2009 年，由一種新型的病毒感染引起基內雷特湖（Kinneret Lake）的羅非魚大量死亡，該病毒被命名為羅湖病毒（Tilapia lake virus，TiLV），這種病毒通過水源等介質傳播[3,6]。2014 年，Marina Eyngo 等[6]通過cDNA 篩選文庫法確定了羅湖病毒（TiLV）的特異性序列（GenBank:KJ605629），長度為1 326 bp，在GenBank 的核酸序列數據庫中未發現同源性序列的存在。

近年來，這種新出現的RNA 病毒，使以色列、厄瓜多爾和埃及等國家養殖的羅非魚大面積死亡[6-8]。2015 年后泰國也大面積感染[9]。2017 年6月，我國臺灣地區、海南文昌地區也檢測出大量陽性樣本，羅非魚養殖業遭到重創[10]。

鑒于該病毒危害的嚴重性，全國水產技術推廣總站要求各級部門應加強對羅湖病毒病的監測，尤其是養殖場在采購羅非魚苗種時，一定要加強對苗種的檢驗檢疫，從源頭上控制羅湖病毒的爆發。Notomi于2000年發明了LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）檢測技術，通過對目標基因的6 個區域，設計4 對特異性引物，利用高活性的鏈置換DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）在60～65℃的恒溫條件下，經過30～60 min 的反應，即可完成病原的檢測[11,12]。該擴增技術是一種新型核酸擴增檢測技術，靈敏度、特異性等都有極大的提升，進而保證檢測結果的準確性，目前已廣泛應用于動物疫病、食品安全等多方面的檢測[13-17]。本文通過對該檢測技術進行改進，針對羅湖病毒特異性的靶基因設計引物，建立實時熒光RT-LAMP 檢測技術，可用于羅非魚苗種企業或養殖場羅湖病毒的檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設備與試劑

恒溫熒光檢測儀（廣州雙螺旋基因科技有限公司），超微量分光光度計，冷凍離心機，PCR 擴增儀，凝膠成像系統，電泳儀，逆轉錄試劑盒（Takara 公司），Bst 2.0 WarmStartDNA Polymerase（New England Biolabs（Beijing）LTD），Premix TaqTMHot Start Version（Takara 公司），dNTP Mixture（10 mM each，Takara），TRIzol試劑（Thermo scientific 公司），質粒提取試劑盒（Omega 公司），T-Vector pMDTM20（Takara 公司），DH5α（Takara 公司）等。

1.1.2 樣品來源

羅湖病毒（TiLV）、草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus Virus，GCRV）、鯉春病毒血癥病毒（Spring Viremia of Carp Virus，SVCV）、病毒性出血性敗血癥病毒（Viral Hemorrhagic Septicemia Virus，VHSV）、傳染性造血組織壞死病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus，IHNV）核酸RNA 來自合作單位廣州雙螺旋基因技術有限公司。31 份實驗樣品采自廣東、海南地區相關的羅非魚養殖場，其中12 份來自廣東省高州市（3 份肝臟組織，2 份大腦組織，7 份腎臟組織），19 份來自海南省文昌市，均為腎臟組織。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成

根據GeneBank 數據庫中登記的TiLV 毒株基因片段（GeneBank：KJ605629）的保守序列，利用LAMP 設計軟件設計引物（表1）。設計的引物交由上海生工生物工程有限公司合成與純化。

1.2.2 RNA 提取與cDNA 合成

采集發病死亡的羅非魚肝臟、腎臟和大腦等組織，采用TRIzol試劑進行固定保存，帶回實驗室后采用RNA 提取試劑盒提取樣本中的病毒總RNA，溶解于100 μL 無RNase A 的水中，于-80℃保存。

根據從Takara 公司購買的逆轉錄試劑盒說明書，按照如下步驟進行逆轉錄得到總的cDNA。提取的RNA 5 μL，oligo dT（50 μmol·L-1）1 μL，dNTP（10 mmol·L-1）1 μL，加入DEPC 水補充到10 μL。充分混勻后于63℃反應5 min，然后冰浴2 min，簡單離心后加入5×buffer 4 μL，RNase inhibitor（40 U·μL-1）0.5 μL，1 μL PrimeScript RTase（200 U·μL-1），混勻離心后于45℃保溫60 min，最后于95℃放置10 min 終止反應。

表1 實時熒光RT-LAMP 引物Tab.1 Real-time RT-LAMP primers

1.2.3 質粒標準品構建

以1.2.2 中合成的cDNA 為核酸模板，采用TiLV 的外引物TiLVOF/TiLVOB 配制PCR 反應體系：2×Premix TaqTM12.5 μL，TiLVOF（10 μmol·L-1）1.0 μL,TiLVOB（10 μmol·L-1）1.0 μL，cDNA 2.0 μL，補水至體系總體積為25 μL。根據如下反應程序進行擴增：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環32 次；72℃延伸10 min。反應完后，電泳切膠回收擴增的目標條帶，純化后連接到T-Vector pMDTM20 載體中，轉化至大腸桿菌DH5α 后涂布平板，挑取克隆進行陽性鑒定、保存。對陽性克隆接種放大培養后采用質粒提取試劑盒提取質粒作為陽性對照，用于后續分析。

1.2.4 實時熒光LAMP 反應體系的建立

1.2.5 靈敏度檢測

將1.2.3 中提取的質粒測得濃度后稀釋定量為1 ng·μL-1，然后用去離子水以10 倍的比例進行梯度稀釋，分別獲得濃度為100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1、1 fg·μL-1、0.1 fg·μL-1和0.01 fg·μL-1的標準質粒濃度，按照上述建立的實時熒光LAMP 反應體系進行檢測，得到該方法對質粒標準品的檢測靈敏度。

1.2.6 實時熒光RT-LAMP 反應體系的建立

為了實現對樣本進行一步法檢測，建立如下實時熒光RT-LAMP 反應體系：按照1.2.4 中建立的實時熒光LAMP 反應體系，加入0.5 μL 逆轉錄酶，以1.2.2 中提取的總RNA 為模板，補充水至25 μL，置于恒溫熒光檢測儀上，設置反應溫度63℃，反應時間45 min，按照1.2.4 中的方法觀察反應結果，同時，與1.2.4 中建立的實時熒光LAMP 法的檢測結果進行比較。

1.2.7 特異性檢測

分別以草魚呼腸孤病毒、鯉春病毒血癥病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、傳染性造血組織壞死病毒等核酸為模板，按照上述建立的實時熒光RT-LAMP反應體系進行檢測，驗證該檢測方法的特異性。

1.2.8 組織樣本的實時熒光RT-LAMP 檢測和RT-PCR 檢測

從廣東、海南地區的羅非魚養殖場收集相關組織樣本31 份，通過病毒RNA 提取試劑盒提取組織樣本的核酸，運用本文建立的實時熒光RT-LAMP方法進行檢測。同時，采用文獻報道的RT-PCR 方法進行平行驗證，統計兩種不同檢測方法的符合率。

表2 RT-PCR 引物[6]Tab.2 RT-PCR primers[6]

2 結果和分析

2.1 目標片段的擴增與質粒標準品構建

實時熒光RT-LAMP 外引物TiLVOF/TiLVOB對目標片段的擴增結果如圖1。由圖1 可知，片段大小約為233 bp，測序表明為目標片段。通過轉化克隆至DH5α 中，放大培養后提取的質粒濃度為64ng·μL-1，按如下公式：拷貝數（copies·μL-1）=6×1023（copies·mol-1）×DNA 濃度（g·μL-1）/質量MW（g·mol-1）換算成拷貝數，提取的質粒相當于1.9×1010copies·μL-1。

圖1 TiLVOF/TiLVOB 引物的PCR 分析結果Fig.1 PCR result of TiLVOF/TiLVOB primers

2.2 引物靈敏度檢測結果

以稀釋的各個濃度的質粒標準品為模板，進行實時熒光LAMP 檢測（圖2）。由圖2 可知，引物對質粒標準品的檢測靈敏度可達到0.1 fg·μL-1，該濃度相當于30 copies/反應的質粒數量。該恒溫檢測儀可顯示陽性判定時間，濃度越高的樣本，顯示陽性的時間更早（表3）。

圖2 實時熒光LAMP 對不同濃度質粒標準品檢測結果Fig.2 The result of Real-time LAMP for different concentration of standard plasmids

表3 核酸濃度與儀器陽性判定時間的關系Tab.3 The relationship between nucleic acid concentration and positive determination time in instrument

2.3 實時熒光RT-LAMP 與實時熒光LAMP 檢測結果的比較

通過對以提取的總RNA 為模板進行一步法實時熒光RT-LAMP 反應，與先進行逆轉錄反應再進行實時熒光LAMP 反應的兩步法進行比較，兩者檢測的結果完全一致，無模板對照均為陰性，陽性對照檢測結果均為陽性（圖3）。

圖3 實時熒光LAMP 與實時熒光RT-LAMP 檢測結果Fig.3 The results of Real-time LAMP method and Realtime RT-LAMP method

2.4 引物特異性檢測結果

通過特異性分析，結果除了羅湖病毒（TiLV）核酸外，其他幾種常見的魚類病毒（GCRV/SVCV/VHSV/IHNV）的核酸均未出現擴增，儀器判定均為陰性（圖4）。

圖4 實時熒光RT-LAMP 檢測方法特異性驗證Fig.4 Specificity of Real-time RT-LAMP method

2.5 組織樣本實時熒光RT-LAMP 和RT-PCR檢測結果的比較

采用本研究建立的實時熒光RT-LAMP 檢測方法，針對在羅非魚養殖基地收集的31 份樣本進行檢測，同時，以文獻中的RT-PCR 方法進行平行檢測（表4）。31 份組織樣本中，RT-PCR 檢測出陽性樣本2 份，實時熒光RT-LAMP 檢測出陽性樣本3 份，陰性樣本28 份。與RT-PCR 方法相比較，檢測結果基本相符，兩者的符合率為97%。

表4 實時熒光RT-LAMP 和RT-PCR 檢測結果比較Tab.4 Detection comparison of Real-time RT-LAMP with RT-PCR

3 討論

羅湖病毒自從出現以來，給泰國乃至全球的羅非魚養殖業造成了重大損失[18]。Bacharach 和Tattiyapong 等[9,19]深入研究了羅湖病毒的基因組DNA及感染性、致病性等。Fathi 等建立了PCR 的檢測方法，但傳統的PCR 方法檢測靈敏度不夠，檢測的靈敏度大概在70,000 copies，而本方法檢測的靈敏度可以達到30 copies[8]。在臨床樣本的檢測中，本方法比RT-PCR 方法多檢測出陽性樣本1 份，通過熒光定量PCR 分析后該樣本確為陽性，這也間接證明了該方法的靈敏度比RT-PCR 方法高，避免了大量的漏檢情況，更好地起到了預警作用[20]。后來，泰國Kembou 和Tattiyapong 等[21，22]用巢式PCR、熒光定量PCR 等方法檢測羅湖病毒，檢測靈敏度分別為7 copies 和2 copies，雖然靈敏度比本文建立的方法高，但巢式PCR 方法仍需要通過變溫設備進行反應，檢測結果需要通過電泳等方法進行判定，無法滿足養殖現場檢測，而熒光定量PCR 需要昂貴的設備和專業的技術人員來輔助檢測，也無法滿足水產行業的要求。本文建立的實時熒光RT-LAMP 檢測方法克服了上述缺點，在保證較高靈敏度的情況下，擺脫了復雜的操作步驟或昂貴儀器的限制。同時，檢測樣本的病毒核酸濃度與儀器陽性判定時間呈現良好遞增關系，可進行半定量檢測，這對于病毒的定量檢測具有實際意義。本文建立的方法特異性好，對魚類常見的其他病毒均無檢出，保證檢測結果的準確性，檢測時間短，可在1 h 內完成，實現樣本的高效檢測。

綜上所述，本文建立的方法非常適合在硬件條件比較薄弱、地理位置相對偏遠的水產養殖現場進行檢測，推廣該檢測技術對羅非魚養殖中羅湖病毒的早期預警和病毒的動態監測具有非常好的效果。