鹽度對凡納濱對蝦血細胞吞噬與免疫相關因子基因表達的影響

展文豪，周書洪，袁春營，崔青曼

（1.天津科技大學海洋與環境學院，天津 300457；2.天津市濱海新區塘沽水產技術推廣站，天津 300450）

凡納濱對蝦（南美白對蝦）Litopenaeus vannamei原產于美洲太平洋沿岸水域，主要分布在秘魯北部至墨西哥灣沿岸，以厄瓜多爾沿岸分布最為集中，是世界水產養殖產量最高的蝦類之一，我國大部分地區均有養殖[1]。鹽度是影響南美白對蝦滲透壓調節的重要因素，顯著影響其增長率、成活率和飼料系數[2]。海水養殖的凡納濱對蝦肝胰腺胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶活力普遍高于淡水養殖的凡納濱對蝦[3]。高鹽能顯著抑制南美白對蝦仔蝦的日增重和存活率，對蝦的總超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性隨鹽度升高均呈現出先升高后降低的趨勢，鹽度50 時達到峰值，酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性隨鹽度升高而上升[4]。低鹽度下南美白對蝦的酚氧化酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶和呼吸爆發活性降低[5]。為了更好地掌握鹽度對凡納濱對蝦免疫功能的影響機制，本研究探討了鹽度對凡納濱對蝦血細胞吞噬能力和免疫相關因子基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

凡納濱對蝦購自天津市寶坻區漁翁水產科技發展有限公司，體長（7.01±0.86）cm，體質量（3.15±1.03）g。鰻弧菌Vibrio anguillarum 由天津市水產研究所贈送。

實驗飼料購自天津凱源飼料有限公司，粒徑為1.0 mm，粗蛋白質38.12%、粗脂肪7.03%、粗纖維4.26%、粗灰分9.87%、鈣2.36%、磷1.41%。

TRIzolTM Reagent試劑盒、M-MLV、Random Primer 及Oligo dT 購自Invitrogen Corporation；RNase inhibitor 及dNTPs 購自上海生工生物工程技術服務有限公司；氯仿、異丙醇及乙醇購自北京索萊寶科技有限公司。Bioprep-6 生物樣品均質儀，杭州奧盛儀器有限公司生產；立式蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠生產；PCR 擴增儀和Gel Doc EZ Imager 凝膠成像系統，美國伯樂公司生產；MIKRO 200R 和UNIVERSAL 320R 臺式冷凍離心機，德國Hettich 科學儀器公司生產；精密pH 計，天津市盛邦科學儀器技術公司生產；電子分析天平，梅特勒-托利多公司（瑞士）。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計與飼養管理

凡納濱對蝦飼養在730 mm×530 mm×450 mm水族箱中，每箱中30 只對蝦，設置3 個鹽度梯度（6、18 和30），每組3 個重復，共計9 個處理組。

實驗持續6 周。按對蝦體質量的4%～5%、每天6:00、11:00、16:00 和21:00 投喂4 次，每次投喂量占日總投喂量的30%、20%、30%和20%。飼養期間連續充氣，水溫27～29 ℃，pH7.8～8.1，溶解氧＞6 mg/L。

1.2.2 凡納濱對蝦血細胞吞噬活性測定

（1）按照文獻[6]采集血淋巴細胞。

（2）熒光標記及血細胞吞噬：1 mL 鰻弧菌菌懸液（106CFU/mL）中加入20 μL FITC（1 mg/mL）進行熒光標記16 h，后續步驟按照文獻[6]進行。細胞吞噬活性用吞噬百分率表示：吞噬百分率（%）=（吞噬細菌的細胞數/細胞總數）×100%。

表1 實驗用的引物序列[6,7]Tab.1 Sequences of the primers used in the experiment

1.2.3 實時定量PCR 分析免疫因子基因表達

血細胞、肝胰腺和鰓組織總RNA 提取按照Trizol 總RNA 抽提試劑盒說明書進行。18S rRNA（內參）、酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）、過氧化氫酶（CAT）、TLR（Toll 樣受體）、免疫缺陷基因（IMD）的引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，其序列見表1。

本實驗用實時熒光定量PCR 反應體系與反應程序見文獻[6]。

1.3 數據處理

實驗數據以mean±SD 表示，采用SPSS 22.0 軟件進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 鹽度對凡納濱對蝦血細胞吞噬活性的影響

由圖1～圖4 可知：鹽度30 和18 組凡納濱對蝦血細胞吞噬活性均顯著高于鹽度6 組對蝦（P＜0.05），鹽度18 組凡納濱對蝦血細胞吞噬活性明顯高于鹽度30 組，但沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 鹽度對凡納濱對蝦免疫相關因子基因表達的影響

圖1 鹽度6 組凡納濱對蝦血細胞的吞噬圖Fig.1 Phagocytosis of blood cells of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei exposed to a salinity of 6

圖2 鹽度18 組凡納濱對蝦血細胞吞噬圖Fig.2 Blood cell phagocytosis of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei in the salinity 18 group

圖3 鹽度30 組凡納濱對蝦血細胞吞噬圖Fig.3 Blood cell phagocytosis of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei in the salinity 30 group

圖4 不同鹽度組凡納濱對蝦血細胞吞噬活性比較Fig.4 Comparison of blood cell phagocytic activity of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei in different salinity groups

由表2、3、4 可知，鹽度30 組凡納濱對蝦肝胰腺組織中TLR、IMD、PO、CAT 及LZM 基因表達水平顯著高于鹽度6 組（P＜0.05）；鹽度18 組凡納濱對蝦肝胰腺組織中TLR、IMD、PO、CAT、LZM 及SOD基因表達水平顯著高于鹽度6 組（P＜0.05）；鹽度30組對蝦肝胰腺組織中的TLR、IMD、PO 基因表達水平顯著低于鹽度18 組（P＜0.05）；鹽度30 組凡納濱對蝦血細胞中TLR、SOD 及LZM 基因表達水平顯著高于鹽度6 組（P＜0.05）；鹽度18 組凡納濱對蝦血細胞中TLR、IMD、PO、SOD 及LZM 基因表達顯著高于鹽度6 組（P＜0.05）；鹽度30 組對蝦的TLR 基因表達水平顯著高于鹽度18 組（P＜0.05），而鹽度30 組對蝦的PO 基因表達水平顯著低于鹽度18 組（P＜0.05）；鹽度30 組凡納濱對蝦鰓組織中TLR 和CAT 基因表達水平顯著高于鹽度6 組對蝦（P＜0.05）；鹽度18 組凡納濱對蝦鰓組織中CAT 和LZM 基因表達水平顯著高于鹽度6 組（P＜0.05）；鹽度30 組對蝦鰓組織中的TLR 基因表達水平顯著高于鹽度18 組（P＜0.05），而鹽度30 組對蝦的CAT 基因表達水平顯著低于鹽度18 組（P＜0.05）；其他因子基因表達水平沒有顯著性差異。

3 討論

3.1 鹽度對凡納濱對蝦血細胞吞噬活性的影響

對蝦免疫系統主要包括細胞免疫和體液免疫，細胞免疫主要指凋亡、封裝、吞噬和結節的形成[8]。本研究發現，不同鹽度下，南美白對蝦血細胞對鰻弧菌的吞噬率明顯不同，鹽度18 組對蝦血細胞的吞噬率最大，鹽度6 組最小。

3.2 鹽度對南美白對蝦免疫相關因子基因表達的影響

鹽度是影響甲殼動物非特異性免疫的重要生態因子。長期低鹽脅迫時，凡納濱對蝦肝胰腺差異表達cDNA 文庫中62.5%的免疫相關基因下調表達[8]；高鹽顯著影響凡納濱對蝦的免疫相關酶活力，對不同組織中免疫酶活力的影響存在一定的組織特異性，50 以上的高鹽脅迫對對蝦免疫相關酶活力的影響尤為顯著[9]。

Toll 和IMD 信號傳導途徑是蝦體中調節先天免疫的重要免疫信號傳導系統[10]。Toll 通路由Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）及其下游效應因子如MyD88、TRIF、TRAM 和TRAF 等組成，機體內的過氧化可以產生TLR 的內源性配體，激活TLR[11,12]。IMD（免疫缺陷基因）途徑是對蝦的另一個重要免疫識別信號傳導通路，Toll 途徑響應革蘭氏陽性細菌和真菌的刺激，IMD 途徑則響應革蘭氏陰性細菌的入侵[11]。本研究發現，對蝦Toll 樣受體（TLR）基因和IMD 基因表達存在組織特異性。TLR 基因在對蝦肝胰腺和血細胞中表達較強，在鰓中較弱，且受鹽度影響較大。鹽度30 和18 組對蝦肝胰腺和血細胞中的TLR 基因表達水平顯著高于鹽度6 組，鹽度30組對蝦鰓中的TLR 基因表達水平顯著高于鹽度6組；IMD 基因在對蝦肝胰腺中表達較強，在鰓和血細胞中較弱，且鹽度30 和18 組對蝦肝胰腺中的IMD 基因表達水平顯著高于鹽度6 組。

表2 鹽度對凡納濱對蝦肝胰腺免疫相關因子基因表達的影響Tab.2 Effects of salinity on expression levels of immune-associated factor genes in hepatopancreas of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

表3 鹽度對凡納濱對蝦血細胞免疫相關因子基因表達的影響Tab.3 Effects of salinity on expression levels of immune-associated factor genes in blood cells of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

表4 鹽度對凡納濱對蝦鰓免疫相關因子基因表達的影響Tab.4 Effects of salinity on expression levels of immune-associated factor genes in gills of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

酚氧化酶以酶原形式存在于甲殼動物血細胞中，血細胞受刺激后將該酶原釋放到血淋巴中，并被激活。它與血細胞的吞噬、包囊以及血淋巴的抗菌活性和外源物質的識別有關[13]。對蝦的酚氧化酶主要存在于大顆粒血細胞中，約占75%，小顆粒血細胞中僅有25%。透明細胞主要具有吞噬功能[14]。鹽度20 組凡納濱對蝦血細胞總數和血清酚氧化酶活力顯著高于鹽度5 組[15]。本研究中的酚氧化酶基因表達水平以對蝦肝胰腺最高，且鹽度30 和18 組對蝦肝胰腺中的PO 基因表達水平顯著高于鹽度6組。

超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）是機體內重要的抗氧化酶，二者相互作用可以清除細胞內產生的過量氧自由基，對機體具有重要保護作用。本研究發現，不同組織中SOD 和CAT 基因表達差異較大，SOD 基因表達以對蝦血細胞最強，CAT基因表達以對蝦鰓組織最強，肝胰腺次之，血細胞最弱。鹽度對SOD 和CAT 基因的表達影響較大，鹽度30 和18 組對蝦血細胞中的SOD 基因表達水平顯著高于鹽度6 組，鹽度30 和18 組對蝦肝胰腺和血細胞中的CAT 基因表達水平顯著高于鹽度6 組。

溶菌酶（LZM）是一種堿性蛋白，廣泛存在于體內多種組織和體液中，是非特異性免疫系統的主要成分，在甲殼動物的免疫中起重要作用[16]。研究發現，鹽度30 和18 組對蝦肝胰腺和血細胞中的LZM基因表達水平顯著高于鹽度6 組，鹽度18 組對蝦鰓組織中的LZM 基因表達水平顯著高于鹽度6 組。

綜上，環境鹽度變化可能通過影響凡納濱對蝦各組織的抗氧化能力、溶菌活性、識別能力和血細胞吞噬活性等，調控凡納濱對蝦細胞免疫和體液免疫。