SETD2調控組蛋白甲基轉移酶H3K36me3的分子機制及其與腫瘤的關系

鄒 園，王思思，伍彩霞，揭 偉，申志華（廣東醫科大學基礎醫學院 .病理學系；2.病理生理教研室，廣東湛江 524023）

表觀遺傳學是指非依賴 DNA序列改變所致的基因表達水平變化，由此引起生物學表型的改變。表觀遺傳學修飾類型主要包括 DNA甲基化、乙?；⒔M蛋白修飾、組蛋白異構體、基因組印記等。DNA甲基化是表觀遺傳學中最重要的修飾機制之一，其主要發生在基因啟動子區域，通過甲基化修飾作用影響染色體結構，從而調控基因轉錄表達。組蛋白甲基化在真核細胞轉錄調控中起著重要作用。SET domain containing 2(SETD2)作為人體組織中唯一的組蛋白第36位賴氨酸三甲基轉移酶(H3K36me3)的修飾酶，其基因突變在人類腫瘤組織中普遍存在，SETD2蛋白低表達與腫瘤臨床進展關系密切。本文旨在從表觀遺傳學角度總結 SETD2在腫瘤形成和發展過程中的作用及機制，為腫瘤防治提供理論基礎。

1 SETD2基因及其編碼蛋白質的結構特征

SETD2別名亨廷頓蛋白相互作用蛋白1，最早由人造血干細胞分離。人類SETD2基因位于3 號染色體短臂(3p21.31)，長約192 kb，由 23個外顯子和22個內含子組成，有 9個轉錄本(剪切變體)，各轉錄本基本生物學信息見表1。全長SETD2蛋白質由2564個氨基酸組成，分子量為280 KDa。SETD2蛋白包含多個結構域，包括(1)SET(Suvar3-9，Enhancer-of-zeste，Trithorax)域：由 AWS、SET和PS(post-SET)模體組成，該結構域是執行組蛋白 H3第36位賴氨酸單甲基化(H3K36me)轉移的催化結構域[1]。(2)H4/H2A相互作用域：由一小段酸性殘基組成，其作用可能是穩定核小體上的 SETD2或將酶結構域定位在組蛋白H3第36位賴氨酸(H3K36)殘基上[1]。(3)WW 和CC域：兩者均為保守區域。WW結構域是富含脯氨酸的蛋白質結合。在細胞核中，RNA聚合酶Ⅱ(RNAPⅡ)的C末端結構域(CTD)會通過與具有該結構域的蛋白質結合調節轉錄。在某些蛋白質中，CC結構域能夠促進同源二聚化。(4)自抑制結構域(AID)：位于SET和WW域之間，作用是抑制 SETD2過度活躍，減少核小體和ATM基因上H3K36me的數量并影響SETD2與RNAPII的作用。(5 )Set2-Rpb1相互作用(SRI)域：通過RNAPII的絲氨酸2(Ser2)和絲氨酸5(Ser5)雙磷酸化CTD重復序列，與H3K36甲基化一起參與轉錄的延長[2]。

2 SETD2與組蛋白H3K36me3調控

組蛋白甲基化及其相關酶是染色質結構和基因轉錄的重要調控因子。SETD2通過多種機制參與組蛋白修飾，組成了復雜的表觀遺傳轉錄調控網絡。近年來，以組蛋白共價修飾為主要標志的表觀遺傳調控研究已成為生命科學前沿快速發展的熱點領域，其中賴氨酸甲基轉移酶成為了調節基因轉錄或信號通路的新靶點。組蛋白賴氨酸特異性甲基化在DNA的各個方面都發揮著重要作用如轉錄、DNA復制、重組和DNA損傷修復。SETD2可能通過以下幾個方面實現對 H3K36me3的調節：(1 )RNAPII CTD中Ser2 和Ser5磷酸化。CTD磷酸化在 H3K36甲基化的調控中起關鍵作用。RNAPII 的CTD激酶CTK1(CTD kinase 1)的缺失或CTD的部分缺失，導致H3K36甲基化的選擇性廢除，表明CTD磷酸化在 H3K36甲基化中的重要作用。其中，SRI結構域與雙重修飾的CTD重復序列(Ser2 和Ser5磷酸化)的特異結合具有高親和力。同時，已經含有磷酸化 Ser2 或 Ser5 的 CTD底物更容易被CTK1磷酸化。但研究發現雙磷酸化的Ser2和Ser5同時出現的頻率較低，這表明Ser2-CTD磷酸化可能是SETD2相互作用的主要標記[1,3]。(2)組蛋白伴侶 Spt6。Spt6作為一種保守的轉錄因子和組蛋白伴侶也調節 SETD2介導的 H3K36me3過程。Spt6蛋白包含一個C 端保守的SH2結構，該結構域被招募到RNAPII的磷酸化CTD中，參與轉錄、mRNA處理和組蛋白修飾的各種因子的招募[4]。H3K36me3需要Spt6、RNAPII的 CTD、CTK1 和SETD2 的 SRI結構域的完整性。而SETD2催化的組蛋白 H3 第36位賴氨酸二甲基化(H3K36me2)在很大程度上獨立于 CTK1依賴的 CTD磷酸化和SETD2的 SRI結構域。CTK1和Spt6相互調節彼此的 SETD2蛋白質穩定性。但是，Spt6維持 Ser2-CTD磷酸化水平的能力弱于 Spt6控制H3K36me的能力[1]。(3 )RNA聚合酶Ⅱ相關因子1(Paf1)復合體。Paf1復合物與RNAPII結合，促進轉錄延長，在轉錄過程中協調多個組蛋白翻譯后修飾[1]。已知Paf1復合體含有Rtf1、Cdc73、Paf1、Ctr9 和Leo1亞基，Paf1復合體組分的缺失對組蛋白H 3 第4 位賴氨酸(H3K4)甲基化水平有不同的影響。Rtf1缺失消除了組蛋白 H3第4位賴氨酸單甲基化(H3K4me)并嚴重降低了組蛋白 H3 第79位賴氨酸單甲基化(H3K79me)，而 Leo1突變不影響 H3K4me 或 H3K79me[5]。研究表明，Paf1C亞單位 Rtf1的組蛋白修飾域(連接 Paf1和RNAPII的 Paf1復合物的一個成員)直接與泛素共軛酶Rad6相互作用并獨立于轉錄刺激 H2Bub[6]。但是，亦有研究表明，Paf1復合物的缺失導致 Ser2-CTD磷酸化水平降低，Paf1的這種作用可能是間接的，且Paf1可能通過與Spt6作用而穩定Spt6，表明Paf1復合物有助于穩定和/或招募Spt6 和CTK1到染色質[7]。一旦加入染色質，CTK1可以磷酸化RNAPII-CTD而結合SETD2[1]。(4)組蛋白 H3K36去甲基化。由于組蛋白甲基化是由組蛋白甲基化酶和去甲基化酶(如LSD1和JHDM1)動態相互調節，因此，組蛋白甲基化也受去甲基化的調節。在芽殖酵母中，有兩種主要的H3K36me去甲基酶，如具有 JmjC結構域的蛋白Jhd1和Rph1。Jhd1作用于 H3K36me 和H3K36me2，而Rph1作用于 H3K36me2和H3K36me3。在高等真核生物中，賴氨酸去甲基酶 KDM2A可以去除H3K36的甲基化，其機制主要是 CpG島直接招募 H3K36特異性 KDM2A，從而產生 CpG島染色質被耗竭。KDM2A利用鋅指CxxC(ZF-cxc)結構域優先識別非甲基化 CpG-DNA。當 CpG-DNA甲基化時，結合被阻斷，從而將KDM2A限制在非甲基化CpG島上而達到去除甲基化的目的。此外，有研究表明KDM2A與異染色質蛋白(HP1)相互作用，將 KDM2A招募到組蛋白 H3第9位賴氨酸三甲基化(H3K9me3)修飾的核小體，介導染色質沉默[8-9]。(5)非編碼RNA。在轉錄前水平，長非編碼RNA HOTAIR 通過減少 SETD2啟動子區域募集 CREB、P300和RNAPII從而抑制SETD2的表達和磷酸化[10]。有研究表明，miR-106b-5p的過度表達導致透明細胞性腎細胞癌(ccRCC)細胞中SETD2的 mRNA和蛋白水平下降[11]。迄今，有關涉及調節 SETD2水平的其他 RNA因子還有待進一步探索。

表1 人SETD2基因轉錄本的基本生物學信息

3 SETD2致癌機制

研究表明 SETD2基因在多種人類腫瘤中普遍存在突變現象，如急性淋巴細胞性白血病、乳腺癌、腎透明細胞癌、結直腸癌和腦膠質細胞瘤等，這可能是眾多腫瘤組織中 SETD2蛋白表達水平低下的原因之一。有關 SETD2異常的致癌機制可能與如下幾個方面關系密切：(1)SETD2突變后下調H3K36me3表達水平，增加了體內錯誤的轉錄起始過程，最終導致基因轉錄異常。H3K36me3與轉錄起始的頻率相關，保證了轉錄的高保真度，從而抑制細胞內隱藏的錯誤轉錄起始過程。此外，在缺乏H3K36me3的腫瘤中，mRNA處理缺陷(包括內含子保留和異常剪接)影響了基因組中多達25%的基因表達。同時，可以觀察到錯配的外顯子附近的核小體占有率降低。同時，H3K36me3在 S期早期達到峰值，表明SETD2在 DNA復制過程中最活躍。另外，在腎癌中，SETD2基因缺陷導致 DNA甲基化缺失，導致核小體致密性異常降低，從而阻礙復制叉的進展，并導致細胞在 S期 積聚[12]。故 RNA的豐度、穩定性或剪接的改變可引起磷酸化蛋白質組的改變，并破壞正常的細胞信號和細胞周期檢查點，導致腫瘤的發生。(2)SETD2水平下降影響了 p53功能。眾所周知，p53是重要的腫瘤抑制基因。在多種SETD2突變的腫瘤中均發現p53蛋白和mRNA水平的降低[13]。研究表明，SETD2與p53的轉激活域(TAD)相互作用，后者與泛素蛋白連接酶 HDM2結合，抑制腫瘤抑制因子的活性并促進其降解來增加 P53的穩定性[14]。(3)維持基因組穩定和促進 DNA損傷修復。組蛋白修飾在DNA雙鏈斷裂(DSB)修復過程中發揮重要作用。H3K36me3通過與MutSα的 PWWP結構域的物理相互作用募集錯配識別蛋白 MutSα來復制染色質，證明H3K36me3與MutSα一起參與保護，免受突變，其在外顯子和活躍轉錄區域中比在內含子和非轉錄區域中共富集得多。相應地，消耗 H3K36me3或破壞H3K36me3 與MutSα相互作用提高了活躍轉錄基因中的自發突變頻率[15]。此外，SETD2功能缺陷腫瘤細胞通常會出現基因組微衛星不穩定性(MSI)，而基因組MSI與腫瘤發生、發展相關[16]。

4 常見腫瘤中SETD2的表達及作用

4.1 泌尿系統腫瘤

腎透明細胞癌(ccRCC)是最常見的成人腎癌。突變、甲基化失活或 von Hippel-Lindau的異常表達是ccRCC發生的主要原因[12]。多項獨立研究對ccRCC臨床樣本進行了蛋白編碼基因和外顯子測序，同樣發現了 SETD2的失活突變。腎癌中的 SETD2不僅在表觀遺傳功能障礙中發揮功能，同樣在細胞代謝調節中起作用[17]。表觀遺傳學修飾方面，H3K36me3可與H4K16ac協同促進轉錄激活，而 SEDT2缺失導致 H3K36me3的蛋白水平明顯下調[18]，影響基因的甲基化修飾。ccRCC也是一種高度“代謝重編程”疾病，能量、營養和氧感應等方面均存在異常[19]。SETD2的缺失可下調肌酸、糖胺聚糖和碳水化合物的代謝過程，通過 PGC1α介導的代謝網絡增強氧化磷酸化和脂質生成[18,20]。這種代謝異常為腎細胞癌的影像學和治療干預新靶點的開發提供了新的機會。

眾所周知，microRNA在轉錄后水平調節基因的表達，其異常在腫瘤發生中的起重要作用。在ccRCC組織和細胞系中，內源性 miR-23b-5p、miR-34b-3p和miR-106b-5p的高表達與SETD2低水平相關，其中miR-106b-5p可直接靶向結合SETD2 mRNA的3'UTR，提示 microRNA可能直接調控 SETD2的表達[21-22]。盡管人們已經認識到 SETD2在調節ccRCC細胞的增殖和凋亡中發揮重要作用，但迄今SETD2在ccRCC中的失活機制仍有待進一步闡明。

4.2 淋巴造血系統腫瘤

以染色體重排為特征的急性白血病需要額外的分子學異常刺激才能發展成完全的惡性腫瘤，然而其協同機制仍不清楚。SETD2在血液惡性腫瘤的發生和治療敏感性中起重要作用。混合系白血病(MLL)基因編碼一種DNA結合蛋白，介導H3K4的甲基化。MLL易位后編碼一種 MLL融合蛋白，失去了H3K4甲基轉移酶調節活性，卻能有效地將造血細胞轉化為白血病干細胞。在MLL重排白血病和復發性急性白血病中常發生SETD2基因突變，SETD2突變的白血病細胞的細胞周期進程、S 和G2/M檢查點調控相關的信號減弱，進而影響DNA復制、有絲分裂和細胞死亡[23]。研究發現，SETD2基因敲除后導致伊馬替尼不敏感和白血病干細胞在慢性髓細胞白血病(CML)細胞系中富集[24]。最新的報道顯示在MLLAF9 AML小鼠模型中使用條件性SETD2基因敲除，純合性SETD2缺失導致MLL-AF9誘導的白血病發生明顯延遲，而雜合子 SETD2缺失則加速疾病發展和化療抵抗[25]。總之，目前對 SETD2在血液性惡性腫瘤中的發病機制尚不清楚。

4.3 呼吸系統腫瘤

肺腺癌中SETD2基因突變較常見。在肺癌中的H3K36me3丟失可破壞染色質的多樣性，如基因剪接、DNA修復、轉錄伸長、DNA甲基化和基因組完整性的維護。SETD2在肺癌的治療中也起著關鍵作用。順鉑是治療非小細胞肺癌(NSCLC)最常用的化療藥物之一。抑制SEDT2表達和SETD2突變可通過抑制 NSCLC細胞中 H3K36me3 和ERK的激活而產生順鉑耐藥性。故SETD2可能在肺癌的發生發展中起到抑癌基因的作用[26]。

報道顯示，與鼻咽部炎癥組織相比，鼻咽癌組織中SETD2 mRNA水平顯著下降[27]。本實驗室也發現，鼻咽癌細胞中 SETD2基因敲除后影響了 20多條與腫瘤密切相關的經典信號通路[28]。由此可知，SETD2在鼻咽癌的發生、發展中發揮重要作用。迄今，有關 SEDT2在鼻咽癌中的研究還處在起步階段，今后仍需進一步探討SETD2在鼻咽癌的作用及機制，為鼻咽癌的治療和預后判斷提供更多的參考信息。

4.4 神經系統腫瘤

惡性原發性中樞神經系統腫瘤是兒童癌癥相關死亡的主要原因。兒童神經膠質瘤中發現SETD2突變率約15%，而成人神經膠質瘤中 SETD2突變率為8%[29]。SETD2的失功能突變在小兒及青年人的晚期神經膠質瘤中可以被發現，但早期神經膠質瘤中卻并未檢測到，這代表SETD2的失功能突變在神經膠質瘤中具有晚期特異性。SETD2失活會導致膠質瘤進展，并向高臨床分期演進。

4.5 骨腫瘤

對骨肉瘤易感犬的外顯子測序發現，骨肉瘤腫瘤表現出高頻率體細胞拷貝數改變。Gardner等[30]研究發現21%的病例中發生了 SETD2突變，其突變類型包含了點突變、移碼插入或刪除等。在對 24名脊索瘤患者的分析中，SETD2突變主要是點突變或拷貝數丟失[31]。有關SETD2與骨肉瘤生物學功能的報道目前尚缺乏。

4.6 消化系統腫瘤

隨著 SETD2表達的增加，胃癌細胞 HGC-27和AGS的遷移、增殖和侵襲能力下降，即SETD2的低表達與胃癌不良預后正相關[32]。SETD2基因失活使小鼠腸上皮促進腸干或祖細胞的自我更新和組織再生[33]。

4.7 其他系統腫瘤

根據 TCGA和代謝數據庫，SETD2在乳腺癌各亞型中均有突變。在所有類型的乳腺癌中，SETD2的表達水平與患者的預后顯著正相關[17,34]。SETD2的表達與乳腺癌分級、分期及淋巴結轉移呈負相關，表明SETD2可能在腫瘤抑制中起作用。由于其與p 53異?；钚韵嚓P，因此可以作為乳腺癌的預后標志物。

SETD2基因在多種人類腫瘤中都存在突變現象，對腫瘤的發生、發展及預后起著重要的作用，這為臨床防治提供了相應的理論基礎。

5 問題與展望

SETD2基因在多種人類腫瘤中失活，并參與腫瘤的發生與臨床進展。基于 SETD2為靶點的表觀遺傳學研究目前正受到研究人員的重視。今后可在如下幾個方面深入研究：(1)明確 SETD2在多種腫瘤組織中呈現的突變現象及其規律，深入闡明常見腫瘤組織中 SETD2的突變熱點。分析常見腫瘤組織中SETD2突變與SETD2表達之間的關系。(2)充分闡明SETD2的病理生理作用?；诂F有的基因組編輯技術，有望獲得SETD2敲除或過表達動物模型，以這些動物模型為對象，分析SETD2表達異常與組織器官發育、分化及系統性疾病的關系。(3)SETD2可作為非組蛋白甲基轉移酶，而非組蛋白的甲基化在腫瘤發生、發展中同樣發揮重要作用。因此，有必要明確 SETD2對下游非組蛋白基因的甲基化修飾情況，從而有望發現新的致病機制。(4)深化基于SETD2靶點的藥物開發。2014年，Cancer Discovery雜志在“研究觀察”專欄中點評“SETD2是協同血液腫瘤發生和維持中的抑癌基因”的重要影響，因此SETD2作為一個新的分子治療靶點，已經在急性白血病的診斷和治療等提供了新的機遇。其中，應用高通量技術為 SETD2作用相關的藥物篩查提供了思路。

綜上，SETD2是一個有巨大潛力的腫瘤分子治療靶點，深入研究 SETD2在腫瘤形成和發展過程中的作用和機制，對于腫瘤的診斷、治療和預防具有重要意義。同時期待隨著表觀遺傳學的深入研究，對SETD2的表達調控通路作出新的解釋。