柱前衍生－高效液相色譜測定手足口病患者血清中多胺水平

張偉健，謝 琪,，曾今誠，黃明元*（廣東醫科大學 .東莞市環境醫學重點實驗室，.東莞市生物活性分子開發與轉化研究重點實驗室，廣東東莞 53808）

多胺是一類含氮的低分子量有機化合物，具有生物活性，一般包括亞精胺(SPD)和精胺(SPM)，它們具有促進細胞分化、增生、生長，在調節核酸與蛋白質的合成及生物膜穩定性等方面起著重要的作用[1]。體內 SPD和SPM水平與惡性腫瘤、心血管疾病、腦血管疾病等疾病的發生發展密切相關[2-4]。目前多胺檢測在紅斑狼瘡[5]、惡性腫瘤患者中均有報道[6]，主要采用高相液相色譜法(HPLC)[7]。手足口病(HFMD)是一類由腸道病毒感染引起的一種發生于5歲以下兒童中的常見疾病[8]。本實驗采用柱前衍生-HPLC測定手足口患兒和健康體檢者血清多胺的濃度，旨為臨床診斷和疾病預防提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、RF-20A xs熒光檢測器(Shimadzu)，5417R冷凍高速離心機(Eppendorf)，氮吹儀REXC100，電動旋渦混旋震蕩器 Vortex-Genie2，Milli-Q超純水儀(Millipore)，電熱恒溫水溫箱(精宏公司)；亞精胺標準品、精胺標準品和丹磺酰氯均購于sigma公司；乙腈為色譜純，氨水、高氯酸、NaOH、NaHCO3等均為分析純。

1.2 標準溶液配制

準確稱取亞精胺和精胺標準品100 mg，用超純水定容至10 mL，放置-20℃冰箱保存；用超純水分別稀釋以上標準品為1 g/L，混合以上單標，再用冷5%高氯酸稀釋成終溶度分別為 20、10、4、2、1、0.5、0.1、0.02 mg/L的混合標準溶液，置于 4℃冰箱保存。

1.3 樣本收集與前處理

根據中國衛生部于2018年發布的《手足口病治療指南》和糞便手足口病病毒檢測陽性診斷結果，收集手足口病患兒(20例)和同期健康體檢者(20例)的血清。

樣本前處理：取250 μL血清，然后12000 r/min，4℃，離心5 min，取200 μL血清，加入冷300 μL 5%HCLO4 沉淀蛋白，渦旋，12000 r/min，4℃，離心10 min，轉移上清400 μL，放置 4℃待衍生[9]。

1.4 衍生化處理

400 μL的標準液和樣品加入200 μL 2 mol/L NaOH和400 μL飽和NaHCO3，然后加上400 μL丹磺酰氯(5 g/L，乙腈做溶劑)，在 60℃水浴加熱避光反應45 min，反應結束后加入100 μL的氨水終止反應并除去多余的丹磺酰氯。

1.5 衍生物的萃取

加800 μL三氯甲烷萃取，3000 r/min，10 min，吸取下層有機相700 μL，以氮氣吹干，殘渣用500 μL乙腈復溶，0.22 μm有機濾膜過濾上樣檢測。

1.6 色譜條件

色譜柱：C18柱 (4.6 mm×250 mm，5μm)，流動相：A項為超純水，B項為乙腈，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1；檢測器：熒光檢測器，激發波長為340 nm，發射波長為510 nm；流速：1 mL/min，進樣體積：10 μL；柱溫：40℃。

2 結果

2.1 亞精胺和精胺色譜圖。

亞精胺和精胺色譜圖見圖1。亞精胺和精胺保留時間分別為14.9、18.8 min，分離效果較好。

圖1 衍生后亞精胺(1)和精胺(2)的 HPLC色譜圖

表1 梯度洗脫程序

2.2 衍生條件優化

按“ 1.4衍生化處理”項下方法,考察衍生 pH 分別為9、10、11時多胺的峰面積，結果見圖 2A；考察衍生劑用量分別為100、200、400、800 μL時多胺的峰面積，結果見圖 2B；考察衍生劑溫度分別為30、40、50、60、70℃時多胺的峰面積，結果見圖 2C；考察反應時間分別為 10、20、30、40、45、50 min時多胺的峰面積，結果見圖 2D。最終確定衍生體系 pH約為 10，衍生劑量為200 μL，反應溫度為60℃，反應時間為45 min。

2.3 標準工作曲線

將冷 5%高氯酸稀釋成終質量溶度分別為 20、10、4、2、1、0.5、0.1、0.02 mg/L的混合標準溶液，置于 4℃冰箱保存，經衍生化進樣測定。以亞精胺和精胺濃度與峰面積采用外標法進行回歸得出標準曲線方程，線性方程亞精胺為y=827755x+38250和精胺為y=957264x+34436，相關系數均＞0.997，亞精胺最低檢測限(LOD)為0.02 mg/L，精胺的最低檢測限(LOD)為 0.01 mg/L。

2.4 精密度實驗

分別取標準溶液質量濃度 0.1、1、10 mg/L作為低中高質量濃度，于上述色譜條件，1 d內重復檢測5次，計算日內精密度和日間精密度。結果見表2，SPD日內精密度(RSD%)為0.18～2.38，日間精密度(RSD%)為0.11～3.14，SPM日內精密度(RSD%)為0.54～0.85，日間精密度(RSD%)為 0.1～1.28。

2.5 穩定性

分別配制低、中、高(0.1、1、10 mg/L)3種質量濃度標準溶液，分別置于-20℃3個月、室溫(25℃)24 h、凍融 3次循環以及衍生反應后24 h來考察SPD和SPM的長期、短期穩定性，結果(表 3)表明 SPD和SPM在本實驗條件下穩定可測；衍生后 SPD和SPM并不太穩定，提示不能重復檢測。

2.6 回收率

圖2 不同衍生條件下亞精胺和精胺的峰面積

表2 亞精胺和精胺的精密度(n=5)

表3 亞精胺和精胺的穩定性(n=3)

配置已知含量(0.5、4、10 mg/L)的質量標準溶液，使用標準添加法，測定回收率。經衍生化處理進樣測定，用標準曲線計算，根據測定質量濃度與實際加入質量濃度計算回收率。結果見表4，SPD回收率在87.98%～99.10%，SPM回收率在96.84%～105.15%。

表4 亞精胺和精胺的回收率(n=4)

2.7 HFMD患兒和健康對照者血清中 SPD 和SPM 含量的檢測

在優化后的實驗條件下，經上述處理，測定20例手足口病患兒及20例健康對照者血清中多胺的水平，SPD和SPM含量見表5。

表5 HFMD患兒和健康對照者血清亞精胺和精胺含量(±s， n=20，mg/L)

表5 HFMD患兒和健康對照者血清亞精胺和精胺含量(±s， n=20，mg/L)

與健康對照者相比：aP＜0.01

3 討論

衍生劑質量濃度在5 g/L時得到最優結果，對衍生劑用量進行優化發現衍生劑量在200 μL時衍生化產物與其他更大劑量相差不大，考慮到成本，確定衍生劑用量為200 μL[10]。有報道發現衍生劑的用量、衍生反應的溫度和時間以及衍生體系的 pH值對丹磺酰氯衍生反應影響很大[11]，pH值過低會影響衍生反應不完全，過高則會干擾，對 pH進行優化結果表示在10.0左右衍生反應最合適；衍生化溫度及衍生時間對實驗結果也會有較大的影響，衍生溫度過高衍生物易分解，衍生溫度過低時衍生反應不完全[5]，經反復試驗發現，60℃衍生反應45 min吸收信號最強。

應用HPLC檢測腫瘤患者生物樣本中的多胺已有多篇研究報道。一項研究報道了局灶性腦缺血患者血液中的亞精胺水平升高[12]；此外，亞精胺與第48小時的臨床結果和第4～6天的梗死體積有關。有趣的是，外源性多胺或多胺抑制劑可以影響一系列的生理活動。例如，亞精胺或精胺預處理顯著抑制缺血/再灌注(I/R)細胞的凋亡，抑制caspase-3和caspase-9的表達，抑制細胞色素c 的釋放，上調Bcl-2的表達，降低[Ca2+][13]。在一個高血壓誘發的充血性心力衰竭模型中，亞精胺的攝入降低了血壓，提高了肌氨酸磷酸化水平，防止了心臟肥厚，表明延遲了心力衰竭的進展[14]。在本研究中，我們研究了亞精胺和精胺在 EV71感染的手足口病中的作用，表 5結果顯示手足口患者與健康對照中的亞精胺和精胺水平差異均有統計學意義，提示亞精胺和精胺在手足口病，特別是 EV71感染的手足口病中高表達，表明生物多胺與手足口病的進展有關。本研究在已有的研究基礎上，優化衍生實驗條件，最終建立了衍生體系pH約為 10，衍生劑量為200 μL，反應溫度為 60℃，反應時間為45 min的高效液相色譜法以檢測手足口患者血清中亞精胺和精胺含量。本方法準確可靠，重復性好，可用于臨床監測手足口病患者體內亞精胺和精胺水平，有待提高的地方為應該增加臨床樣本量和疾病臨床分期，更深層次挖掘多胺與手足口病之間的聯系，為臨床診斷和疾病預防提供參考。