腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子1 和血管內(nèi)皮因子在口腔鱗癌組織中的表達(dá)及其與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

陳旭斌，陳 坤，周 昊，張鐵柱，王敬雯（.海南省人民醫(yī)院口腔頜面外科，海南海口 570；.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，廣東湛江 5400；.湖北省武漢市癌灶醫(yī)院口腔科，湖北武漢 4004）

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是頭頸部常見的惡性腫瘤，雖然近 50年間其手術(shù)、放化療及生物治療等方面取得了長足的進(jìn)步，但 OSCC患者 5年生存率仍低于50%[1]，其預(yù)后差和病死率較高的主要原因是腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個多因素、多步驟、多基因參與的復(fù)雜過程，其中細(xì)胞外基質(zhì)的降解、細(xì)胞的粘附、腫瘤血管的生成及生長因子、趨化因子的誘導(dǎo)等發(fā)揮著重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子1 (MTA1)是與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，并與各種實體腫瘤血管生成有關(guān)；血管內(nèi)皮因子(VEGF)是促進(jìn)新生血管生成的基因，可為腫瘤的生長、增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)[2]，然而有關(guān)MTA1與VEGF在 OSCC組織中的表達(dá)及相關(guān)性鮮見文獻(xiàn)報道。本實驗采用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)及免疫組織化法(IHC)檢測MTA1和VEGF在 OSCC組織中的表達(dá)，了解MTA1和VEGF與OSCC侵襲、組織病理學(xué)分級及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2011年9月－2013年9月在廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科住院的 40例 OSCC患者，男 23例，女17例；舌癌 20例，頰癌 8例，牙齦癌 9例，口底癌3例；年齡27～69歲，平均43.6歲。所有患者術(shù)前均未行放化療，經(jīng)組織病理學(xué)確診，行OSCC灶擴(kuò)大切除+頸淋巴清掃術(shù)。術(shù)后切取標(biāo)本，分為 2組：一組行石蠟切片，用于 HE常規(guī)染色和IHC檢測；另一組即刻液氮冷凍，－80℃貯存，用于RT-PCR檢測。

1.2 主要試劑及儀器

鼠抗人 MTA1單克隆抗體、兔抗人 VEGF單克隆抗體、GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(含 DAB相關(guān)試劑)購自基因科技(上海)有限公司；RT試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司；Trizol、DEPC購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 組織的石蠟包埋及切片，蠟塊行4 μm厚切片，按 GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用免疫組織化學(xué)檢測試劑盒操作法：烤片，石蠟切片脫蠟和水化，微波修復(fù)抗原，滴加一抗(用3%BSA-PBS封閉液1∶ 50稀釋一抗)，室溫復(fù)溫45 min，PBS沖洗3次，吸干，滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，吸干，加入稀釋好的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)二抗，室溫下濕盒孵育30 min；使用DAB顯色試劑盒，加試劑盒中 A、B、C試劑各1 滴(約50 μL)，混勻后加至切片，避光保存，室溫顯色，中性樹膠封片，顯微鏡觀察拍照。實驗中設(shè)陽性對照和陰性對照。

1.3.2 實時定量PCR檢測 每個標(biāo)本分3 組，分別采用兩步染料嵌合熒光RT-PCR法檢測MTA1、VEGF和GAPDH mRNA水平，Master Cycler Gradient PCR儀和LightCycler480ⅡDNA擴(kuò)增儀進(jìn)行分析：Trizol溶液提取標(biāo)本組織總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，再進(jìn)行實時熒光定量 PCR檢測。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計、合成，見表1。實時定量PCR反應(yīng)，獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算機(jī)分析Ct值。△CT=目的基因 CT－內(nèi)參 CT；△△CT=(目的基因△CT－正常組織△ CT的均值)；相對表達(dá)量=2-△△CT。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以χ2檢驗分析 MTA1在 OSCC組織與正常組織中表達(dá)的差異，Spearman分析 OSCC組織中 MTA1與VEGF表達(dá)的相關(guān)性，單因素方差分析MTA1 mRNA在 OSCC組織、癌周組織和癌周正常組織中的相對表達(dá)量及其與臨床病理學(xué)的關(guān)系，雙因素方差分析 MTA1 mRNA與VEGF mRNA相對表達(dá)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 IHC結(jié)果判定

MTA1陽性表達(dá)位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒物狀(圖 1)；VEGF陽性表達(dá)位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒物狀(圖 2)。圖3 為陰性對照。

2.2 MTA1 和VEGF 在OSCC組織中的表達(dá)

MTA1在癌灶周圍正常組織和OSCC組織中的陽性率表達(dá)分別為20.0%和62.5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；VEGF在癌灶周圍正常組織和OSCC組織中的陽性率表達(dá)分別為17.5%和57.5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。MTA1在低、中及高分化組的OSCC組織中表達(dá)的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；伴有與不伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的 OSCC組織中 MTA1陽性率表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表2。

表1 MTA1、VEGF和GAPDH引物序列

圖1 OSCC組織MTA1 IHC (×200)

圖2 OSCC組織VEGF IHC(×200)

圖3 陰性對照(×200)

表2 MTA1在 OSCC組織中的表達(dá)與其臨床病理因素的關(guān)系

2.3 MTA1 和VEGF 在OSCC組織中表達(dá)的相關(guān)性

MTA1和VEGF在 OSCC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.588，P＜0.05)，見表3。

表3 MTA1和VEGF表達(dá)的相關(guān)性分析

2.4 qRT-PCR 結(jié)果判定

MTA1和VEGF 的 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增曲線可見所有樣品均進(jìn)入擴(kuò)增平臺期，證明反應(yīng)條件設(shè)定準(zhǔn)確(圖4、5)；MTA1和VEGF的 PCR產(chǎn)物溶解曲線可見溶解峰值大致相同，說明產(chǎn)物單一，無非特異性產(chǎn)物和引物二聚體等產(chǎn)生干擾，證明所擴(kuò)增的產(chǎn)物特異性較好(圖6、7)。

圖4 擴(kuò)增曲線(MTA1)

圖5 擴(kuò)增曲線(VEGF)

圖6 融解曲線(MTA1)

圖7 融解曲線(VEGF)

2.5 MTA1 mRNA和VEGF mRNA的相對表達(dá)量

MTA1 mRNA和VEGF mRNA在 OSCC癌灶組織、癌周邊緣組織及癌周正常組織中的相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表4。

2.6 MTA1 mRNA 和VEGF mRNA在 OSCC組織中表達(dá)的關(guān)系

MTA1 mRNA 和VEGF mRNA 在 OSCC組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.826，P＜0.01)。

表4 OSCC各組織中MTA1 mRNA相對表達(dá)量(±s， n=40)

表4 OSCC各組織中MTA1 mRNA相對表達(dá)量(±s， n=40)

兩兩比較均P＜0.01

3 討論

3.1 MTA1 在OSCC組織中的表達(dá)與其臨床病理因素的關(guān)系

口腔鱗狀細(xì)胞癌是口腔最常見的惡性腫瘤，占口腔頜面部惡性腫瘤90%以上[3]，其生物學(xué)特性主要表現(xiàn)為局部浸潤性生長及早期發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致OSCC患者死亡的重要原因之一。對OSCC發(fā)生早期的頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，目前的檢測方法難以作出正確的臨床診斷。因此，對OSCC侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制及相關(guān)基因的研究，有助于為OSCC的早期診斷、治療及預(yù)防提供理論依據(jù)。

MTA是最近發(fā)現(xiàn)的一個基因家族，包括MTA1、MTA2 和MTA3。研究表明 MTA1在人體多種腫瘤中存在異常高表達(dá)，并與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[4]。Kawasaki等[5]發(fā)現(xiàn) MTA1在 OSCC組織中高表達(dá)與OSCC侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。劉建平等[6]研究證實食管鱗癌中MTA1 與VEGF-c的表達(dá)呈正相關(guān)，其可能共同促進(jìn)食管鱗癌淋巴管的形成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。翟榮等[7]發(fā)現(xiàn) MTA1在 OSCC癌灶組織較癌周正常組織高表達(dá)，MTA1 與OSCC病理分級、有無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。王永霞等[8]通過免疫組化及原位雜交法研究顯示 MTA1蛋白和MTA1 mRNA 在 OSCC中明顯高于口腔黏膜白斑及口腔黏膜。綜上所述，國內(nèi)外研究均證實 MTA1在腫瘤中的表達(dá)與人體多種實體腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成有關(guān)，并在OSCC中呈高表達(dá)。本實驗采用RT-PCR 和IHC法檢測MTA1 在OSCC癌灶組織、癌周邊緣組織及癌周正常組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示MTA1 在OSCC組織中呈高表達(dá)，且在低、中分化組中 MTA1的表達(dá)明顯高于高分化組，提示MTA1 在OSCC中的高表達(dá)可能與其發(fā)生及惡性程度有關(guān)；伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的 MTA1表達(dá)明顯高于無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，提示MTA1 在OSCC組織中的表達(dá)與其頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，MTA1的高表達(dá)可能在OSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起重要作用。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。因此，我們認(rèn)為MTA1在OSCC組織中的高表達(dá)與OSCC的侵襲及頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且與OSCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

3.2 VEGF 在OSCC組織中表達(dá)與MTA1表達(dá)的相關(guān)性

VEGF在腫瘤的實質(zhì)、間質(zhì)和上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，且通過自分泌或者旁分泌方式在腫瘤生長、血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。Naruse等[9]研究顯示p-mTOR+/HIF-1α+/VEGF-A+表達(dá)與OSCC的腫瘤分級、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵潤分級有關(guān)，結(jié)果證明mTOR/HIF-1α/VEGF通路影響OSCC的發(fā)生、發(fā)展。本研究采用RT-PCR 和IHC法檢測 VEGF mRNA與VEGF蛋白在OSCC癌灶組織、癌周邊緣組織及癌周正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF 在OSCC組織中的表達(dá)高于癌灶周圍正常組織，提示 VEGF在OSCC中的高表達(dá)可能與OSCC的發(fā)生及侵襲有關(guān)。

Du等[10]研究顯示直腸癌中 MTA1高表達(dá)與腫瘤直徑大小有關(guān)，且 MTA1的表達(dá)水平與腫瘤微血管密度有關(guān)，同時還證實MTA1、VEGF-C的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床 dukes標(biāo)準(zhǔn)分期有關(guān)；高表達(dá)的MTA1可使 VEGF mRNA和VEGF蛋白的表達(dá)上調(diào)，而用小干擾 RNA(siRNA)敲低 MTA1表達(dá)后，VEGF mRNA及其蛋白的表達(dá)水平均降低。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測發(fā)現(xiàn)，相較空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的直腸癌細(xì)胞，MTA1高表達(dá)的直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)液中存在更高含量的VEGF，相反，控制組MTA1沉默的直腸癌細(xì)胞所分泌的 VEGF大量減少。Yang等[11]研究顯示，在子宮內(nèi)膜癌中MTA1和VEGF表達(dá)均高于正常子宮內(nèi)膜組織，且兩者的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床分級、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肌層侵潤有關(guān)，二者表達(dá)呈正相關(guān)。本研究采用Spearman分析MTA1、VEGF 在 OSCC組織中表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示 MTA1 和VEGF 在 OSCC組織中的陽性率分別為62.5%、57.5%，MTA1 與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)；同時，采用雙因素方差分析 MTA1 mRNA和VEGF mRNA 在 OSCC組織中的相對表達(dá)量，結(jié)果呈正相關(guān)，提示 MTA1 和VEGF 在 OSCC的侵襲轉(zhuǎn)移中可能起協(xié)同作用。

3.3 MTA1 與VEGF 在OSCC腫瘤微環(huán)境中的作用

研究發(fā)現(xiàn)[12]，腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中創(chuàng)造了獨立的低氧高酸性微環(huán)境，這種條件更適合腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，并且認(rèn)為腫瘤微環(huán)境中必定有一些成分與適應(yīng)腫瘤細(xì)胞變化有關(guān)。腫瘤微環(huán)境主要包括腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管和淋巴管等。這些細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。特定的腫瘤微環(huán)境可以通過影響腫瘤細(xì)胞的增殖、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)水平、誘導(dǎo)血管生成以及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生[11]。腫瘤新生血管的形成不僅是腫瘤微環(huán)境的基礎(chǔ)，也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，腫瘤必須不斷地產(chǎn)生新生血管，才能維持其繼續(xù)生長。腫瘤血管與正常血管有以下不同：結(jié)構(gòu)不同、形狀呈彎曲狀或囊狀、較老化及排布雜亂無章。血管的異常導(dǎo)致血液在不同的時間、空間下對腫瘤進(jìn)行異常的灌注。異常灌注可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞缺氧及細(xì)胞外 pH值降低，而缺氧又可導(dǎo)致腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、遺傳的不穩(wěn)定性、血管形成、免疫抑制、炎癥反應(yīng)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等。缺氧可以上調(diào)VEGF的表達(dá)，VEGF又可以促進(jìn)異常結(jié)果的腫瘤微血管形成，因此形成惡性循環(huán)。本研究證實VEGF在 OSCC組織中的表達(dá)明顯高于癌灶周圍正常組織，這與Aggarwal等[13]研究結(jié)果一致，說明 VEGF可能與OSCC微環(huán)境中異常血管的生成及 OSCC的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。有研究顯示 MTA1在促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移比VEGF更有潛力，MTA1可在腫瘤與非腫瘤環(huán)境中誘導(dǎo)產(chǎn)生血管[14]。Sun等[15]用蛋白印跡分析法檢測胰腺癌中缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-α)和VEGF在體外和體內(nèi)的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn) MTA1過表達(dá)可增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力，同時可升高 HIF-α和VEGF蛋白在體外和體內(nèi)表達(dá)水平，而 MTA1被抑制則相反。

綜合上述，MTA1是一個潛在的促血管生成的分子，MTA1與VEGF的相互作用調(diào)節(jié)腫瘤血管的形成及侵襲轉(zhuǎn)移。本研究采用IHC 及 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，MTA1和VEGF 在 OSCC組織中表達(dá)呈正相關(guān)，這與上述研究結(jié)果一致，提示 MTA1和VEGF在OSCC腫瘤微環(huán)境中起重要的作用，二者可能在OSCC的侵襲轉(zhuǎn)移中起協(xié)同作用。