青蒿素對(duì)自發(fā)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腰椎骨密度及力學(xué)的影響

朱覺(jué)新，黃永梅，黃連芳*（廣東醫(yī)科大學(xué) .廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；.海洋醫(yī)藥研究院，廣東湛江 5403）

自發(fā)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的病因尚不完全清楚，多與遺傳、環(huán)境和雌激素等因素有關(guān)[1]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡致股骨頭壞死[2]，骨密度下降和長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療患者易發(fā)生骨壞死[3]，超聲下可見(jiàn)骨侵蝕、滑膜增生、能量多普勒超聲滑膜炎、腱鞘炎等多種病變[4]；未發(fā)現(xiàn)骨壞死患者皮質(zhì)骨發(fā)現(xiàn)空骨陷窩，骨小梁中央可見(jiàn)無(wú)活力骨細(xì)胞，其周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[5]，股骨頭部分骨細(xì)胞體積縮小，伴核固縮，較多骨細(xì)胞壞死溶解成碎片，伴成骨細(xì)胞凋亡[6]。Nevskaya等[7]整理文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀的骨壞死發(fā)生率達(dá) 28.52%，因此，結(jié)締組織病患者存在不同程度的骨代謝異常，骨質(zhì)疏松發(fā)生率較高[8]。青蒿為菊科植物黃花蒿的地面上的干燥部分，味苦、辛，性寒，歸肝、膽經(jīng)，具有清虛熱、除骨蒸、解暑熱、截瘧、退黃的功效[9]，其主要有效成分為青蒿素，青蒿素類衍生物為蒿甲醚、雙氫青蒿素(DHA)等。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)青蒿及其有效成分和衍生物治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮膚病如濕疹、光敏感性皮膚病等具有良好療效[10]，蘇穎杭等[11-13]觀察青蒿素硫酸羥氯喹復(fù)方的中、高劑量組對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎有一定的抗炎作用，青蒿素干預(yù)治療MRL/lpr狼瘡鼠，血清及腎組織MDA水平均明顯升高。目前青蒿素治療SLE的療效研究主要集中在免疫抑制和抗炎方面，對(duì)于青蒿素及其衍生物治療紅斑狼瘡后骨骼的改變?nèi)绾危貏e是腰椎骨密度和力學(xué)變化少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察青蒿素對(duì) SLE小鼠腰椎骨密度及力學(xué)的影響，為 SLE導(dǎo)致的骨損壞的青蒿素臨床治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥物

青蒿素的衍生物二氫青蒿素(71939-50-9，批號(hào)K913006-CN30，純度≥98%，上海笛柏生物科技有限公司)，經(jīng)食用油配成1.5%的溶液，給藥劑量150 mg/kg。醋酸潑尼松片(批號(hào)160604，廣東華南醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)，劑量6 mg/kg，用生理鹽水配成0.06%的混懸溶液。

1.2 動(dòng)物與分組

24只紅斑狼瘡小鼠[購(gòu)買于南京大學(xué)模型動(dòng)物研究中心的實(shí)驗(yàn)鼠，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2015-0001：6周齡雌性 B6.MRL-Faslpr/J小鼠(供體株MRL/MpJFaslpr，背 景 株 C57BL/6J，狼瘡小鼠(20.0±2.0) g、C57BL/6J野生型小鼠]在廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心屏蔽系統(tǒng)環(huán)境中飼養(yǎng)，質(zhì)量合格證明No.32002100001211，按“廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)研究所和國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南”進(jìn)行飼養(yǎng)。將其隨機(jī)分為3 組，即青蒿素組、潑尼松組和生理鹽水組，每組8只。另選取 8只健康的 6周齡 C57BL/6J野生型(WT)小鼠作為對(duì)照組(健康對(duì)照組)，每組分籠飼養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

瑞士小動(dòng)物活體顯微成像CT(Scanco Micro-CT VIVA 40)，美國(guó)生物力學(xué)儀(ElectroForce，3200 Series)。

1.4 方法

1.4.1 給藥 根據(jù)人類 SLE的治療劑量換算或參考文獻(xiàn)[7]等確定二氫青蒿素、醋酸潑尼松給藥劑量，保持濕度50%～60%，室溫24～28℃等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件。(1)青蒿素組：二氫青蒿素，150 mg/kg，灌胃，1次/d；(2)潑尼松組：醋酸潑尼松，6 mg/kg，灌胃，1次/d；(3)生理鹽水組：生理鹽水0.1 mL/10 g，灌胃，1次/d；(4)健康對(duì)照組：生理鹽水0.1 mL/10 g，灌胃，1次/d。用藥90 d后，小鼠眼球取血處死后取材，左側(cè)脛骨 Scanco Micro-CT VIVA 40掃描、骨三維重建；腰椎3、4 節(jié)行生物力學(xué)壓縮性能試驗(yàn)。

1.4.2 掃描、骨三維重建 取腰椎進(jìn)行高分辨率Scanco Micro-CT VIVA 40掃描、三維重建，參數(shù)如下：X球管電壓70 KVP，最大功率8 W，焦點(diǎn)直徑7 μm，圖像矩陣4096×4096像素，掃描尺寸38.9 mm×145 mm，CPU r×2800 i2。3D骨重建和圖像分析骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)：總體積、骨骼體積、骨體積分?jǐn)?shù)、連接性骨密度、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)、骨小梁數(shù)量、厚度、骨組織骨密度、骨小梁分離度等。

1.4.3 生物力學(xué)腰椎壓縮性能測(cè)試 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剔除腰椎第3、4節(jié)的肌肉及軟組織，用生理鹽水紗布將其包裹，再用錫紙、密封袋裝好，負(fù) 20℃冰箱冷存，檢測(cè)時(shí)恢復(fù)室溫，通過(guò)生物力學(xué)測(cè)試儀進(jìn)行壓縮性能實(shí)驗(yàn)。儀器設(shè)置參數(shù)：椎體正中線為加壓點(diǎn)，Limits(Load -40,450)，加載速率2.0 mm/min，自動(dòng)記錄 Load等對(duì)應(yīng)的最大載荷參數(shù)等。Load性能測(cè)試指標(biāo)包括彈性模量、彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 腰椎微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較

與生理鹽水組、潑尼松組相比，青蒿素組小鼠的骨小梁數(shù)量、骨體積分?jǐn)?shù)、連接性骨密度與骨組織骨密度均明顯增加，骨小梁分離度與結(jié)構(gòu)模型指數(shù)均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與健康對(duì)照組比較，青蒿素組小鼠的腰椎微結(jié)構(gòu)指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

2.2 生物力學(xué)腰椎壓縮性能測(cè)試指標(biāo)

與生理鹽水組、潑尼松組比較，青蒿素組小鼠的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷明顯增加(P＜0.05)，與健康對(duì)照組比較，青蒿素組小鼠的生物力學(xué)腰椎壓縮性能指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

3 討論

SLE疾病導(dǎo)致骨代謝異常、微結(jié)構(gòu)變差，骨吸收明顯增加，骨形成抑制，骨量丟失，骨質(zhì)侵蝕，軟骨破壞，關(guān)節(jié)畸形，力學(xué)性能也隨之下降。SLE普遍發(fā)生骨密度(BMD)下降，骨質(zhì)疏松發(fā)生率顯著升高[14]。激素治療雖然改善了小梁微結(jié)構(gòu)，但骨生物力學(xué)性能和骨質(zhì)量沒(méi)有得到緩解，且長(zhǎng)期激素治療易發(fā)生激素性股骨頭或肱骨頭壞死、肌無(wú)力、冠狀動(dòng)脈病變，腎性高血壓、長(zhǎng)期加重心臟負(fù)荷等引起高脂血癥、心絞痛、心肌損害及心力衰竭等。有研究顯示，長(zhǎng)期服用小劑量潑尼松，骨密度有顯著的降低，服用大劑量潑尼松，骨股頭壞死的發(fā)生率越高[15-16]。Lucinda等[17]觀察到成骨細(xì)胞的 Bax表達(dá)在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥中增加。分析原因可能是激素使機(jī)體的凝血-纖溶系統(tǒng)存在明顯的功能障礙[18]。本研究結(jié)果中顯示，使用潑尼松治療SLE可使骨吸收有所下降，骨小梁稀疏變薄，骨量減少，分離度增加，連接骨密度和骨小梁密度明顯下降，改善了小梁微結(jié)構(gòu)，但與健康對(duì)照組比較，腰椎微結(jié)構(gòu)與生物力學(xué)腰椎壓縮性能等指標(biāo)的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，即不能恢復(fù)至正常。

表14組小鼠腰椎微結(jié)構(gòu)參數(shù)變化(±s， n=8)

表14組小鼠腰椎微結(jié)構(gòu)參數(shù)變化(±s， n=8)

與健康對(duì)照組比較：aP＜0.05；與生理鹽水組比較：bP＜0.05；與潑尼松組比較：c P＜0.05

圖1 青蒿素對(duì)SLE小鼠腰椎的三維結(jié)構(gòu)圖

表2 藥物治療對(duì)自發(fā)性紅斑狼瘡小鼠腰椎生物力學(xué)變化的影響(±s， n=8)

表2 藥物治療對(duì)自發(fā)性紅斑狼瘡小鼠腰椎生物力學(xué)變化的影響(±s， n=8)

與健康對(duì)照組比較：aP＜0.05；與生理鹽水組比較：bP＜0.05；與潑尼松組比較：c P＜0.05

青蒿為菊科植物黃花蒿，現(xiàn)代中藥藥理學(xué)證明青蒿的主要成分是青蒿素，具有抗瘧、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗菌等作用[19]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用而廣泛應(yīng)用于紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等治療。已有研究證實(shí)，青蒿素的藥理作用機(jī)制與Wnt/β-Catenin、NF-κB、RasMAPK、PPAR、Notch等信號(hào)通路相關(guān)[20-21]，這些通道都與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的分化增殖、功能調(diào)節(jié)密切相關(guān)，特別是對(duì)成骨細(xì)胞調(diào)控相關(guān)信號(hào)通道的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與生理鹽水組、潑尼松組相比，青蒿素組骨小梁數(shù)量、骨體積分?jǐn)?shù)、連接性骨密度、骨組織骨密度、斷裂載荷、最大載荷、彈性載荷等均明顯增加(P＜0.05)，骨小梁分離度與結(jié)構(gòu)模型指數(shù)均明顯減少(P＜0.05)，與健康對(duì)照組比較，青蒿素組腰椎微結(jié)構(gòu)與生物力學(xué)腰椎壓縮性能等指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說(shuō)明青蒿素改善 SLE所致的骨量減少、連接密度與小梁密度明顯下降、骨吸收明顯增加等骨微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)腰椎壓縮性能，骨代謝正常，且有效阻止 SLE導(dǎo)致的小鼠骨量丟失，顯著抑制其骨吸收增加，不降低骨形成。

綜上所述，青蒿素改善 SLE所致的骨微結(jié)構(gòu)惡化和骨生物力學(xué)壓縮性能下降，阻止 SLE導(dǎo)致的小鼠骨量丟失。文章主要研究二氫青蒿素的作用，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中只有1個(gè)劑量組。本實(shí)驗(yàn)是預(yù)實(shí)驗(yàn)，目的是初步觀察二氫青蒿素對(duì) SLE小鼠骨損害的防治作用。本文中二氫青蒿素的劑量是根據(jù)臨床上二氫青蒿素治療 SLE的劑量換算而來(lái)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們下一步接著要做二氫青蒿素高、中、低劑量對(duì) SLE骨損害的干預(yù)作用，篩選出最佳使用劑量范圍，為其臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。