青蒿素對自發性系統性紅斑狼瘡小鼠腰椎骨密度及力學的影響

朱覺新，黃永梅，黃連芳*（廣東醫科大學 .廣東天然藥物研究與開發重點實驗室；.海洋醫藥研究院，廣東湛江 5403）

自發性系統性紅斑狼瘡(SLE)的病因尚不完全清楚，多與遺傳、環境和雌激素等因素有關[1]。系統性紅斑狼瘡致股骨頭壞死[2]，骨密度下降和長期應用糖皮質激素治療患者易發生骨壞死[3]，超聲下可見骨侵蝕、滑膜增生、能量多普勒超聲滑膜炎、腱鞘炎等多種病變[4]；未發現骨壞死患者皮質骨發現空骨陷窩，骨小梁中央可見無活力骨細胞，其周圍有炎性細胞浸潤[5]，股骨頭部分骨細胞體積縮小，伴核固縮，較多骨細胞壞死溶解成碎片，伴成骨細胞凋亡[6]。Nevskaya等[7]整理文獻發現無癥狀的骨壞死發生率達 28.52%，因此，結締組織病患者存在不同程度的骨代謝異常，骨質疏松發生率較高[8]。青蒿為菊科植物黃花蒿的地面上的干燥部分，味苦、辛，性寒，歸肝、膽經，具有清虛熱、除骨蒸、解暑熱、截瘧、退黃的功效[9]，其主要有效成分為青蒿素，青蒿素類衍生物為蒿甲醚、雙氫青蒿素(DHA)等。近年來發現青蒿及其有效成分和衍生物治療系統性紅斑狼瘡、皮膚病如濕疹、光敏感性皮膚病等具有良好療效[10]，蘇穎杭等[11-13]觀察青蒿素硫酸羥氯喹復方的中、高劑量組對大鼠佐劑性關節炎有一定的抗炎作用，青蒿素干預治療MRL/lpr狼瘡鼠，血清及腎組織MDA水平均明顯升高。目前青蒿素治療SLE的療效研究主要集中在免疫抑制和抗炎方面，對于青蒿素及其衍生物治療紅斑狼瘡后骨骼的改變如何，特別是腰椎骨密度和力學變化少見報道。本研究通過觀察青蒿素對 SLE小鼠腰椎骨密度及力學的影響，為 SLE導致的骨損壞的青蒿素臨床治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 藥物

青蒿素的衍生物二氫青蒿素(71939-50-9，批號K913006-CN30，純度≥98%，上海笛柏生物科技有限公司)，經食用油配成1.5%的溶液，給藥劑量150 mg/kg。醋酸潑尼松片(批號160604，廣東華南醫藥集團有限公司)，劑量6 mg/kg，用生理鹽水配成0.06%的混懸溶液。

1.2 動物與分組

24只紅斑狼瘡小鼠[購買于南京大學模型動物研究中心的實驗鼠，動物生產許可證號：SCXK(蘇)2015-0001：6周齡雌性 B6.MRL-Faslpr/J小鼠(供體株MRL/MpJFaslpr，背 景 株 C57BL/6J，狼瘡小鼠(20.0±2.0) g、C57BL/6J野生型小鼠]在廣東醫科大學動物中心屏蔽系統環境中飼養，質量合格證明No.32002100001211，按“廣東省實驗動物監測研究所和國家實驗動物監測研究所實驗動物保護和使用指南”進行飼養。將其隨機分為3 組，即青蒿素組、潑尼松組和生理鹽水組，每組8只。另選取 8只健康的 6周齡 C57BL/6J野生型(WT)小鼠作為對照組(健康對照組)，每組分籠飼養。

1.3 實驗儀器

瑞士小動物活體顯微成像CT(Scanco Micro-CT VIVA 40)，美國生物力學儀(ElectroForce，3200 Series)。

1.4 方法

1.4.1 給藥 根據人類 SLE的治療劑量換算或參考文獻[7]等確定二氫青蒿素、醋酸潑尼松給藥劑量，保持濕度50%～60%，室溫24～28℃等實驗動物飼養條件。(1)青蒿素組：二氫青蒿素，150 mg/kg，灌胃，1次/d；(2)潑尼松組：醋酸潑尼松，6 mg/kg，灌胃，1次/d；(3)生理鹽水組：生理鹽水0.1 mL/10 g，灌胃，1次/d；(4)健康對照組：生理鹽水0.1 mL/10 g，灌胃，1次/d。用藥90 d后，小鼠眼球取血處死后取材，左側脛骨 Scanco Micro-CT VIVA 40掃描、骨三維重建；腰椎3、4 節行生物力學壓縮性能試驗。

1.4.2 掃描、骨三維重建 取腰椎進行高分辨率Scanco Micro-CT VIVA 40掃描、三維重建，參數如下：X球管電壓70 KVP，最大功率8 W，焦點直徑7 μm，圖像矩陣4096×4096像素，掃描尺寸38.9 mm×145 mm，CPU r×2800 i2。3D骨重建和圖像分析骨微結構參數：總體積、骨骼體積、骨體積分數、連接性骨密度、結構模型指數、骨小梁數量、厚度、骨組織骨密度、骨小梁分離度等。

1.4.3 生物力學腰椎壓縮性能測試 實驗結束后，剔除腰椎第3、4節的肌肉及軟組織，用生理鹽水紗布將其包裹，再用錫紙、密封袋裝好，負 20℃冰箱冷存，檢測時恢復室溫，通過生物力學測試儀進行壓縮性能實驗。儀器設置參數：椎體正中線為加壓點，Limits(Load -40,450)，加載速率2.0 mm/min，自動記錄 Load等對應的最大載荷參數等。Load性能測試指標包括彈性模量、彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷等。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 腰椎微結構參數比較

與生理鹽水組、潑尼松組相比，青蒿素組小鼠的骨小梁數量、骨體積分數、連接性骨密度與骨組織骨密度均明顯增加，骨小梁分離度與結構模型指數均明顯減少，差異均有統計學意義(P＜0.05)。與健康對照組比較，青蒿素組小鼠的腰椎微結構指標的差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1、圖1。

2.2 生物力學腰椎壓縮性能測試指標

與生理鹽水組、潑尼松組比較，青蒿素組小鼠的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷明顯增加(P＜0.05)，與健康對照組比較，青蒿素組小鼠的生物力學腰椎壓縮性能指標差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

3 討論

SLE疾病導致骨代謝異常、微結構變差，骨吸收明顯增加，骨形成抑制，骨量丟失，骨質侵蝕，軟骨破壞，關節畸形，力學性能也隨之下降。SLE普遍發生骨密度(BMD)下降，骨質疏松發生率顯著升高[14]。激素治療雖然改善了小梁微結構，但骨生物力學性能和骨質量沒有得到緩解，且長期激素治療易發生激素性股骨頭或肱骨頭壞死、肌無力、冠狀動脈病變，腎性高血壓、長期加重心臟負荷等引起高脂血癥、心絞痛、心肌損害及心力衰竭等。有研究顯示，長期服用小劑量潑尼松，骨密度有顯著的降低，服用大劑量潑尼松，骨股頭壞死的發生率越高[15-16]。Lucinda等[17]觀察到成骨細胞的 Bax表達在糖皮質激素誘導的骨質疏松癥中增加。分析原因可能是激素使機體的凝血-纖溶系統存在明顯的功能障礙[18]。本研究結果中顯示，使用潑尼松治療SLE可使骨吸收有所下降，骨小梁稀疏變薄，骨量減少，分離度增加，連接骨密度和骨小梁密度明顯下降，改善了小梁微結構，但與健康對照組比較，腰椎微結構與生物力學腰椎壓縮性能等指標的差異仍有統計學意義(P＜0.05)，即不能恢復至正常。

表14組小鼠腰椎微結構參數變化(±s， n=8)

表14組小鼠腰椎微結構參數變化(±s， n=8)

與健康對照組比較：aP＜0.05；與生理鹽水組比較：bP＜0.05；與潑尼松組比較：c P＜0.05

圖1 青蒿素對SLE小鼠腰椎的三維結構圖

表2 藥物治療對自發性紅斑狼瘡小鼠腰椎生物力學變化的影響(±s， n=8)

表2 藥物治療對自發性紅斑狼瘡小鼠腰椎生物力學變化的影響(±s， n=8)

與健康對照組比較：aP＜0.05；與生理鹽水組比較：bP＜0.05；與潑尼松組比較：c P＜0.05

青蒿為菊科植物黃花蒿，現代中藥藥理學證明青蒿的主要成分是青蒿素，具有抗瘧、抗炎、解熱、鎮痛、抗病毒、抗菌等作用[19]。近年來發現其具有抗炎及免疫調節作用而廣泛應用于紅斑狼瘡、類風濕關節炎等治療。已有研究證實，青蒿素的藥理作用機制與Wnt/β-Catenin、NF-κB、RasMAPK、PPAR、Notch等信號通路相關[20-21]，這些通道都與成骨細胞、破骨細胞的分化增殖、功能調節密切相關，特別是對成骨細胞調控相關信號通道的影響。實驗結果表明，與生理鹽水組、潑尼松組相比，青蒿素組骨小梁數量、骨體積分數、連接性骨密度、骨組織骨密度、斷裂載荷、最大載荷、彈性載荷等均明顯增加(P＜0.05)，骨小梁分離度與結構模型指數均明顯減少(P＜0.05)，與健康對照組比較，青蒿素組腰椎微結構與生物力學腰椎壓縮性能等指標的差異均無統計學意義(P＞0.05)。說明青蒿素改善 SLE所致的骨量減少、連接密度與小梁密度明顯下降、骨吸收明顯增加等骨微結構和生物力學腰椎壓縮性能，骨代謝正常，且有效阻止 SLE導致的小鼠骨量丟失，顯著抑制其骨吸收增加，不降低骨形成。

綜上所述，青蒿素改善 SLE所致的骨微結構惡化和骨生物力學壓縮性能下降，阻止 SLE導致的小鼠骨量丟失。文章主要研究二氫青蒿素的作用，實驗設計中只有1個劑量組。本實驗是預實驗，目的是初步觀察二氫青蒿素對 SLE小鼠骨損害的防治作用。本文中二氫青蒿素的劑量是根據臨床上二氫青蒿素治療 SLE的劑量換算而來。根據本實驗的結果，我們下一步接著要做二氫青蒿素高、中、低劑量對 SLE骨損害的干預作用，篩選出最佳使用劑量范圍，為其臨床合理應用提供依據。