1例成骨不全患者致病基因鑒定

趙 強，黃泳華，馮穗華，冼詩瑤，潘焯儀，吳欣新，張妙蓮，吳海濤（廣東省江門市中心醫院，廣東江門 529000）

成骨不全(OI)是一種以骨量降低、骨骼脆性增加、反復骨折及藍鞏膜為主要特征的單基因遺傳病，在新生兒中發生率約為1/20000[1-2]。成骨不全臨床表型異質性和遺傳異質性都非常強，臨床表型譜非常豐富，不同患者臨床表現差異非常大，可以僅表現為骨密度稍低，也可有嚴重骨骼異常，甚至出現嬰兒期致死[3-4]。1979年Sillence根據臨床表現和遺傳方式將其分為 4種亞型[5]，隨著基因檢測技術的發展，成骨不全相關致病基因被陸續鑒定發現[6]，目前按致病基因分類已達十余種。通過檢索OMIM及 Pubmed數據庫可發現，目前已報道與成骨不全臨床表現明確相關基因已有 10余個，其中大多數已報道病例均是由常染色體顯性基因COL1A1和COL1A2所引起[7]，COL1A1和COL1A2為Ⅰ型膠原蛋白編碼基因。近年來不斷有報道由常染色體隱性基因突變所導致的成骨不全病例[8]，這些基因可調節Ⅰ型膠原蛋白的轉錄后修飾、分泌及加工[2]。由于各亞型在臨床表現及影像學特征上的重疊，成骨不全的臨床診斷及分類一直都比較困難[9]。隨著近年高通量基因測序技術在臨床診斷上廣泛應用，尤其適應于成骨不全這類臨床表現度及遺傳異質性均較復雜的疾病分子診斷。在本研究中，我們對1 例疑似成骨不全的家系使用相關基因捕獲測序方法，對測序數據進行生物信息學過濾、篩選及分析，鑒定該成骨不全家系致病性基因突變，并對基因突變進行家系遺傳機制分析及相關功能學預測研究，以期為其臨床診斷、預防及后續生育阻斷提供有效的分子診斷信息。

1 病例資料

1.1 研究對象

患兒為 10歲女孩，自4 歲起反復骨折，查體及X線檢查顯示雙下肢及前臂彎曲畸形，胸骨畸形，雙下肢及肱骨多處骨折(圖 1)，無明顯壓痛，伴有牙發育不良，藍色鞏膜(圖 2)，聽力正常。臨床診斷為疑似成骨不全，但一直未進行相關基因檢測。患兒父母均無類似臨床表現，自述無家族史。本研究采集患兒及父母外周血，并采用本地 50名正常個體外周血作為對照。本研究獲得醫院倫理委員會審核批準，所有研究對象均征得本人或監護人同意，并簽署知情同意書。

圖1 患兒 X射線照

圖2 患兒鞏膜及牙齒發育臨床表現

1.2 標本處理

使用5 mL EDTA抗凝管采集患兒及其父母外周血，使用DNA提取商品化試劑盒(QIAamp DNA Blood Midi Kit，Qiagen，Germany)，按產品說明書提取各研究對象DNA。

1.3 成骨不全相關基因捕獲測序

使用超聲波儀將提取的基因組DNA打斷為約100～500 bp小片段，然后通過磁珠篩選打斷后DNA片段，篩選出主片段大小為150～200 bp，末端補平后在 3' 端加堿基“ A”采用華大基因(BGI，Shenzhen，China)定制芯片與患者DNA庫于47℃雜交16～24 h，該芯片包含 13個成骨不全目標基因編碼區及臨近剪接位點區捕獲探針(表 1)，雜交結束后進行探針洗滌和洗脫反應。文庫經片段大小、濃度檢測，合格后各文庫進行 pooling、定量，然后行單鏈環化。環化后的文庫經過制備形成 DNA納米球，利用高通量測序儀 BGISEQ-500(BGI，Shenzhen，China)連續雙向測序。

1.4 測序下機數據分析

下機原始數據(Raw reads)進行測序質量評估，去除低質量以及被接頭污染的reads[10]。隨后用BWA軟件(Burrows Wheeler Aligner) 與HG19人類基因組數據庫進行序列比對[11]，GATK軟件進行SNV(single nucletide mutation) 和Indel(insertion and deletion)鑒定，生成目標區域堿基多態性結果，隨后進行數據庫(NCBI dbSNP，HapMap，1000 human genome dataset和database of 100 Chinese healthy adults)比對，并對鑒定出的可疑突變進行注釋及篩選，突變致病性評估是基于ACMG流程[12]。

1.5 Sanger測序驗證

使用Oligo7軟件針對疑似致病突變及周邊區域設計擴增引物，對患兒及其父母基因組DNA進行突變區域特異性 PCR擴增，擴增產物經純化后，進行Sanger測序反應，判斷二代測序鑒定出的疑似致病突變是否真實，且突變是否符合遺傳規律。

1.6 基因突變生物功能分析和預測

通過國內外文獻檢索、致病突變數據庫(HGMD和Clinvar)及突變后對基因表達翻譯的影響判斷突變功能影響。通過Human Splicing Finder、Maxant Scan及NNSplice軟件預測內含子突變對 mRNA剪接的影響及產生新剪接位點可能性。

2 結果

2.1 基因捕獲高通量測序及數據過濾

患兒經過 13個成骨不全致病基因捕獲測序，獲得了相關基因外顯子區及鄰近 15個堿基的內含子區域的堿基序列片段，經一系列生信過濾分析，測序數據各質量參數均合格見表1。

2.2 候選基因突變過濾篩選

鑒定出單堿基突變及 20個堿基以下缺失插入突變共 22個，經過分析篩選流程，最終篩選出P3H1基因中一對復合雜合突變為患兒疑似致病突變，分別為c.2164C＞T(p.Q722*) 和c.466-7T＞G，其中突變c.466-7T＞G未有文獻及數據庫報道，屬于新突變，見表2。

表1 測序數據質量參數值

表2 候選致病變異篩選流程

2.3 家系Sanger測序驗證

針對c.2164C＞T(p.Q722*)和c.466-7T＞G位點設計PCR擴增引物，對患兒及其父母行 PCR擴增，擴增產物進行 Sanger測序驗證，其中突變c.2164C＞T(p.Q722*)來源母親，突變 c.466-7T＞G來源于父親，見圖3。

2.4 生物信息分析及預測

突變 c.2164C＞T(p.Q722*)為無義突變，導致722位氨基酸提前產生終止密碼子，使得722位及后續氨基酸無法翻譯，P3H1蛋白發生截斷。而突變c.466-7T＞G位于內含子區域，經預測該突變導致新剪接位點產生及原剪接位點破壞可能性較大。其中Human Splice Finder軟件評估野生型和突變后的CV (consensus value)分別為56.84和85.79(陽性閾值為 65)，ΔCV為+50.93%(陽性閾值為+10%)。其中Maxant Scan軟件評估野生型和突變CV(consensus value)分別為-2.32和6.26(陽性閾值為 3)，ΔCV為+369.83%(陽性閾值為+30%)，見圖4。

3 討論

圖3 家系中P3H1 c.466-7T＞G 和c.2164C＞T (p.Q722*) Sanger測序圖

圖4 突變c.466-7T＞G基因剪接功能預測

P3H1基因編碼脯氨酰-3-羥化酶-1，該蛋白屬于參與膠原生物合成、折疊及組裝的膠原羥化酶家族成員，它與CRTAP蛋白、PPIB蛋白組成膠原蛋白翻譯后修飾復合體，負責對I型膠原蛋白單個脯氨酸殘基進行羥基化[13-14]。P3H1是一個常染色體隱性致病基因，該基因純合突變或復合雜合突變可導致成骨不全 VIII型，通過檢索 HGMD及 Pubmed數據庫，目前已報道的P3H1致病性突變已有 60多個，其中無義突變、錯義突變及剪接位點突變占大多數。本研究對疑似成骨不全患者使用成骨不全相關基因捕獲測序，通過生物信息分析及篩選，鑒定出 P3H1基因復合雜合突變 c.2164C＞T(p.Q722*) 和c.466-7T＞G為疑似致病性突變，患兒其余 12個成骨不全基因內未發現符合遺傳機制的突變。

其中 c.2164C＞T(p.Q722*)為無義突變，2017年Huang等[9]報道該突變 c.2164C＞T(p.Q722*)和c.105_120del(p.D36Rfs*16) 為1 例產前成骨不全Ⅷ型胎兒的致病突變，他們通過Western Blot實驗顯示攜帶該突變患兒 P3H1蛋白表達缺失，而 mRNA表達水平并無顯著降低。Cabral等[13]報道P3H1的無義突變會導致終止密碼子提前出現，可能通過無義突變介導降解機制使得mRNA和蛋白表達水平降低。Chang等[15]也通過Western blots和免疫熒光顯微鏡檢測技術，證實P3H1無義突變可導致蛋白表達降低或缺失，而mRNA表達水平是正常的。通過上述研究可判斷突變c.2164C＞T(p.Q722*)影響 P3H1蛋白表達，為成骨不全VIII型致病性突變。

另一突變 c.466-7T＞G位于P3H1的 1號內含子剪切位點區域，通過檢索 HGMD數據庫及文獻均未報道該突變，屬于新突變。通過檢索數據庫及文獻，發現多篇文獻報道P3H1基因剪切位點區域突變為成骨不全 VⅢ致病性突變，其中大多數為剪切供體和受體突變，還有3個病例研究報道致病突變位于剪切位點深部區域(如：c.1170+5G＞C、c.1473+3A＞C和c.2055+18G＞A)[16-18]，其中 c.2055+18G＞A突變可導致 mRNA表達降低及新的剪接體出現。本研究通過多個剪接位點預測軟件對突變 c.466-7T＞G分析，均提示該突變很可能導致新剪接方式產生，從而影響該基因轉錄和翻譯。對該患兒進行隨訪，其父告知患兒已去世，后續未能繼續進行體內功能學研究。

本研究對1 例疑似成骨不全患兒使用 13個成骨不全致病基因高通量測序，鑒定出P3H1基因內 2個復合雜合突變，在本地 50例正常對照(100條染色體)中均未發現這 2個突變。其中 c.2164C＞T(p.Q722*)為已報道的致病性突變，而 c.466-7T＞G未有文獻報道和數據庫收錄，但有文獻報道P3H1基因內含子內突變影響基因剪切，導致成骨不全 VⅢ型。本研究通過目前主流基因剪切位點突變功能預測軟件，推測該突變影響P3H1基因的剪切，導致蛋白構造及功能發生改變。由于人體內功能學實驗無法進行，后續條件允許情況下，可進一步在體外細胞和動物水平研究該突變相關功能。