ABA和UV-B輻射對小麥葉片角質層的影響

張彩艷

關鍵詞：ABA;UV-B輻射;葉片角質層;蠟質

1 小麥葉片角質層概述

植物地上器官的表皮覆蓋的一層連續薄脂類物質稱為角質層。根據角質層的位置、結構和化學成分可分為3層：最外層是由無定形的晶體或半晶體結構形成的表層角質;其下方是中層角質層，由細胞壁纖維素等材料構成，是由細胞壁外表皮分泌的角質沉積形成;中層角質層的下方是內層角質層，含有細胞壁分泌物，主要是纖維素。表層角質和中層角質中含有蠟質，主要由飽和的超長鏈脂肪酸組成，有減少水分流失的作用[1]。

角質層的重要功能是減少植物表面的水分流失，在防止紫外線輻射傷害、抵抗病蟲害的侵入方面也起到重要作用，同時在植物適應外界環境方面也起到重要作用。

在增強UV-B輻射對小麥葉片影響的研究中發現，溫室種植的小麥在0、8.82和12.60 kJ∕m²3種劑量的UV-B輻射下，其內源脫落酸（Abscisic Acid，ABA）和游離脯氨酸含量的變化表明，UV-B輻射導致葉綠體膜脂肪酸配比改變和UFA降低、葉片MDA含量升高以及ABA和游離脯氨酸積累。分析表明，UV-B輻射對膜系統的損壞可能是內源ABA和游離脯氨酸含量增加的原因之一，而后者也是植物抵抗UV-B脅迫所作出的適應性反應。

1.1 ABA對植物角質層影響的研究成果

在有關ABA對玉米影響的研究中發現，適應干旱環境的玉米品種的植物角質層較生活在正常環境下厚且蒸騰率較低。結構類似的葉片在氣孔關閉的情況下，蒸騰率已被證明與角質層的厚度成反比，而且蠟質的含量與失水率呈現相關性。ABA還可以加強玉米抗氧化防護系統，保護細胞免受氧化損傷，保障可溶性滲透劑（如脯氨酸）維持細胞內的水分;同時，ABA參與葡萄的抗低溫脅迫;ABA還參與植物的抗鹽脅迫，通過誘導氣孔關閉，加強與鹽脅迫相關基因表達等一系列脅迫應答反應，ABA信號誘導植物向抗鹽代謝調節途徑轉化，最終增強植物對外界鹽環境的適應性，緩解受鹽脅迫的危害程度。在干旱、ABA和鹽脅迫下，擬南芥角質層顯著增加，每單位面積蠟質增加32%～80%，蠟質中烷烴增加29%～98%，干旱使角質層增厚49%，ABA對角質層也有一定影響[2]。

1.2 研究目的

本次實驗主要研究ABA和UV-B輻射對小麥葉片透性、角質層結構、蠟質等的影響以及它們之間的關聯性。

2 材料方法

2.1 小麥品種

選取的小麥品種是臨優2018，是一種水地生不抗旱品種，由山西省農科院小麥研究所提供。

2.1.1 材料培養

取完全相同的健康飽滿的種子，在室溫下浸泡24 h。待小麥種子萌動長出胚芽后，移入培養缽，每缽均勻種植9棵。在每個培養缽中裝入相同質量的培養基。培養基基質用蛭石。營養土按質量比1∶1混和。

2.1.2 培養條件

自然條件培養，光周期為12 h;空氣濕度為70%;溫度為白天25 ℃，夜間20 ℃[1] 。

2.1.3 實驗方法

（1）對照組。正常澆水培養，每隔兩天澆一次水，共培養18天。

（2）ABA處理。正常澆水培養小麥到第11天（第3片葉子完全長出時），用100 μmol/L的ABA均勻噴灑，每3天噴灑一次，共噴灑兩次。

（3）UVB處理。先在正常條件下培養小麥到第11天后（第3片葉子完全長出時），將小麥幼苗置于10.08 kJ/m²/d UVB照射下，每天照射8 h，光周期為光照8 h、黑暗16 h。共處理4天。

2.2 掃描電鏡觀察

2.2.1 試劑配制

福爾馬林-乙酸-乙醇（Formalin-Aceto-Alcohol，FAA）固定液的配方：福爾馬林（30%甲醛）5 mL，冰醋酸5 mL，70%酒精90 mL。

2.2.2 掃描電鏡觀察

將不同處理條件下的小麥葉片中部2～3 mm²的小塊在室溫下固定在FAA試劑中，放入一系列酒精（35%、50%、70%、80%、95%、100%）中脫水3次。然后，用醋酸異戊酯置換3次，每次20 min。到達臨界點（HITACHI HCP-2）再用離子濺射（EIKO IB-3），最后用掃描電鏡（HITACHIS-3400N）觀察。由某老師送至北京進行掃描電鏡拍照觀察。

2.3 葉片失水率測定

將經過處理的小麥和對照組的小麥植株置于黑暗中，分別取不同處理的對照組小麥同一葉位且葉面積大致相同的葉子（第二片葉子），剪下并立即浸入蒸餾水中60min，之后去掉多余水分，在完全黑暗的條件下，每30min用微量天平稱重一次，直到180 min，共稱重6次，各取3個重復。記錄實驗結果，計算出每組葉片的失水率。最后以時間為橫坐標，失水率為縱坐標作圖。

2.4 葉綠素外滲率測定

分別取經過處理的、和對照組小麥同一葉位的葉片（第二片葉子），截成約3 cm的小段，用電子天平稱量，使每組葉子質量相同。將實驗材料浸于裝有15 mL 80%乙醇溶液的小瓶中，并將小瓶放到搖床上輕輕搖動，保持搖床的溫度低于20 ℃，防止溫度過高導致葉綠素分解。每隔30 min分別取出100 μL液體，用745分光光度計分別測出其在645、663 nm波長下的葉綠素吸光度值，并根據下列公式計算出葉綠素外滲率。

每個時間點與24 h時測量的葉綠素質量濃度的百分比即為葉綠素的外滲率。

2.5 單位面積葉片的蠟質質量測定

分別取每種條件處理下的小麥葉片和對照組的小麥葉片（每張平均10 cm，第3片葉子）6張，測出葉面積后，剪成2～3 cm的小段。將裝有15 mL三氯甲烷的錐形瓶放入水浴鍋中加熱至60 ℃，將葉片浸入三氯甲烷60 s，然后立即取出葉片，放入錐形瓶，并用封口膜封住錐形瓶口（防止蠟質變性）放入冰箱。待其自然風干。待三氯甲烷風干至剩1 mL時，移入事先稱好的EP管中，待其完全風干。稱量風干后的EP管質量。（風干后EP管的質量-空EP管的質量）∕葉片的面積即單位面積葉片的蠟質質量。

葉片面積的測量方法：取一張A4紙，分別量出長和寬，精確計算出面積S（cm²），用電子天平稱取A4紙的質量M（g），計算出A4紙單位面積的質量p。將剪下的葉片標號，在A4紙上描出葉片的圖形。將描出的葉片剪下并稱取質量m。葉片面積的計算公式如下：

S=m∕p （4）

3 ABA、UV-B輻射對小麥表型的影響

ABA處理和UV-B輻射結束后，比較對照組和經過ABA處理、UV-B輻射小麥表型的差異可以發現，對照組小麥長勢良好，植株直立，葉片健康長勢均勻，顏色碧綠，發黃葉片較少;而經過ABA處理、UV-B輻射后的小麥葉片出現不同程度的倒伏，葉片長勢雜亂，有較多葉片出現葉尖發黃現象，同一處理下第3片葉子葉尖發黃的比例明顯多于第一和第二片葉子。統計各條件下小麥葉尖發黃的數量占總葉片數的比例，衡量小麥受損程度（見表1）。

由表1可知，在對照組中，小麥葉尖發黃的葉片所占比例最小，而UV-B輻射下小麥葉尖發黃葉片所占比例大于ABA處理條件下的發黃率，且兩者都大于對照組。

4 討論

實驗結果表明，經ABA處理和UV-B輻射后，小麥表型變化明顯，植株出現倒伏，實驗組葉尖發黃的葉片數所占比例明顯高于對照組，說明ABA和UV-B輻射對小麥造成了一定影響。其中，UV-B輻射對小麥的損害尤其嚴重。

角質層是由角質和透水性差的蠟質組成，所以推測在這一過程中起主導作用的是角質層中的蠟質。對單位面積蠟質質量測定的實驗表明，具有較低失水率和葉綠素外滲率的實驗組單位面積蠟質質量高于對照組。根據擬南芥角質層的研究發現，蠟質沉積增多以及蠟質晶體分布變化會使葉片水分散失和葉綠素外滲速率減慢，表明蠟質含量的增多在降低小麥葉片葉綠素外滲率的過程中起主導作用。

綜上所述，ABA和UV-B輻射可增加葉片角質層厚度、表皮毛豎立和單位面積蠟質質量，進而降低葉片失水率和葉綠素外滲率，而單位面積蠟質質量在這一過程中起主導作用。

實驗結果還表明，UV-B輻射后的小麥葉片角質層厚度和單位面積蠟質質量都高于ABA處理后的小麥，而UV-B輻射后的小麥具有較低的失水率和葉綠素外滲率，進一步證明了上述實驗結果[2]。

本次實驗表明，ABA和UV-B輻射可以促進小麥葉片角質層增厚和表皮毛的合成，是前人尚未研究過的，但對這一促進作用的分子生物學機制尚不清楚，有待作進一步的研究。