基于VEGF/VEGFR-2信號通路研究淫羊藿苷促進大鼠脛骨干骨折愈合的作用機制

鄭州大學附屬鄭州中心醫院 鄭州 450000

骨折是指骨的力學連續性、完整性丟失，以骨折處疼痛、腫脹、功能障礙、異常活動等主要臨床表現，是常見的外科疾病之一[1]。骨折愈合是極為復雜的組織學修復過程，其中血管新生貫穿于整個骨折愈合過程，從血腫機化期、原始骨痂形成期到骨痂改造塑形期都有血管新生的參與。臨床已證實血液供應是影響骨折愈合情況的主要因素[2-3]，因此促進血管新生是加快骨折愈合的關鍵。淫羊藿苷（icariin，ICA）是提取自淫羊藿莖葉的總黃酮類物質，具有調節免疫功能、改善內分泌、抗腫瘤等多種藥理學功能[4]。近年來有研究指出，ICA可通過激活血管生成信號分子，刺激血管新生，為骨折治療提供新的可能[5]。血管內皮生長因子/血管內皮生長因子受體-2（vascular endothelial growth factor/vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGF/VEGFR-2）信號通路在血管新生過程中起著關鍵作用，研究證實該信號通路介導和參與了骨折愈合過程[6]。然而，目前鮮有基于VEGF/VEGFR-2信號通路研究ICA對骨折愈合影響的報道。鑒于此，本研究建立大鼠脛骨干骨折模型，研究ICA對大鼠脛骨干骨折愈合的作用并探討相關機制，以期指導臨床。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）雄性SD大鼠50只，8周齡，體質量（300±20）g，飼養于鄭州大學實驗動物中心 [實驗動物使用許可證號碼：SYXK（豫）2011-0001]，溫度（23±2）℃，濕度（50±5）%，明暗周期12h/12h，所有大鼠適應性飼養7d。

1.2 藥物、主要試劑和儀器 ICA購于上海源葉生物科技有限公司（批號：20120706）；復方骨肽注射液購于常州方圓制藥有限公司（劑量：5mL/75mg，國藥準字：H20065416）；戊巴比妥鈉購于上海化學試劑總廠試劑二廠（批號：820219）；Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司（批號：79407）；RT-Kit逆轉錄試劑盒購于上海Roche公司（批號：4897030001）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司（批號：AR0146）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上樣緩沖液購于上海雷浩信息科技有限公司（批號：B1007）；Tris緩 沖 液（Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20，TBST）購于南京安培化工科技有限公司（批號：SBJ-1020）；VEGF、VEGFR-2單抗均購于美國Abcam公司（批號：ab32152、ab245725）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體購于碧云天生物技術有限公司（批號：A0208）。

數字化X線攝片機為美國hologic公司產品；BX51顯微鏡購于日本Olympus株式會社；Inveon Research Wofkplace軟件購于德國西門子股份公司；Image Pro-Plus Software 6.0 IPP軟件為美國微軟公司產品；Electro Force 3200生物力學性能測試儀購于美國BOSE公司；Viva CT40微計算機斷層掃描（microcomputed tomography，Mirco-CT） 機購于瑞士SCANCO Medical AG公司；ChemiDoc XRS化學發光成像分析系統為美國Bio-rad公司產品。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及分組 參照文獻[7]，采用鋸開法建立大鼠脛骨干骨折模型。所有SD大鼠均以2%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉，6%硫化鈉于左下肢備皮后，以右側臥位固定于造模臺。碘伏消毒左足至左大腿上段，于脛骨結節下方2mm沿脛骨脊作1.5cm縱向切口，剝離外皮，繼續沿脛骨脊外側0.5mm位置將淺筋膜與深筋膜層縱向切開，游離脛骨前肌群，暴露脛骨外骨面。采用5mL注射器針頭于脛骨髕韌帶開口，插入克氏針沿髓腔達脛骨粗隆間，于脛骨中段前方最高點鋸開約3mm左右缺損，缺損達骨髓腔，形成脛骨中段橫行骨折。繼續插入克氏針穿過骨折位置貫穿整個脛骨髓腔，固定骨折，剪除多余克氏針，將其遠端埋于骨皮質下。以0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后逐層縫合切口，涂抹適量紅霉素軟膏，連續3d每天注射8萬U青霉素以預防感染。術后即刻于大鼠麻醉狀態下拍攝患肢X線片，建模成功標準：脛骨中段斜形或橫形骨折，骨折端內固定效果理想，未發生明顯移位。50只大鼠建模成功41只、失敗9只，將建模成功的41只大鼠隨機分為對照組 （10只）、ICA低劑量組（10只）、ICA高劑量組（10只）、陽性藥物組（11只）。

1.3.2 術后干預 術后第2天開始進行干預，參照文獻[8]結合前期研究確定ICA的劑量，ICA低、高劑量組分別為40mg/（kg·d）、80mg/（kg·d）。ICA采用0.9%氯化鈉溶液溶解，以5mL/（kg·d）的劑量腹腔注射，1次/d。陽性藥物組采用復方骨肽注射液治療，取0.4mL溶于0.9%氯化鈉溶液，以5mL/（kg·d）的劑量腹腔注射，1次/d。對照組以等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，1次/d。各組均連續干預21d。

1.3.3 Mirco-CT活體掃描 干預第7、14、21天進行Mirco-CT活體掃描。掃描前以2%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉，保持大鼠俯臥位，屈曲雙下肢，使股骨縱軸平行于Mirco-CT床滑軌的移動軸，在心電監護下行活體掃描。掃描分辨率47μm，掃描電壓80kV，電流500μA，旋轉角度360°，掃描時間2 000ms，幀平均數6，掃描范圍為骨折線上下5mm。采用標準體模校準掃描結果，圍繞骨痂沿股骨縱軸取100個掃描層面，上下各50個，建立感興趣區。采用Inveon Research Wofkplace軟件定量分析獲取的三維圖像信息，計算樣本骨體積分數（bone volume/total volume，BV/TV）和骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）。

1.3.4 生物力學測試 末次行Mirco-CT活體掃描后脫頸處死大鼠，完全剝離左下肢脛骨，采用骨水泥固定其兩端避免加載時旋轉移位，取等長骨架，采用生物力學性能測試儀進行三點彎曲實驗。以所取脛骨段中點為加載點，承載點跨距30mm，加載速度2mm/min，記錄各組最大載荷。

1.3.5 血管新生情況觀察 處死大鼠后，以骨折位置作為中心，上下各取5mm×5mm骨痂組織標本，以4%多聚甲醛固定24h，組織塊常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，制作成厚度5μm的切片，脫蠟后蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光鏡下拍照，采用Image ProPlus Software 6.0 IPP軟件測定新生血管面積，并計數新生血管數量，在骨痂愈合平面單位視野內隨機選取10個不相鄰視野，計算每個視野平均值。

1.3.6 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantiative Real-time polymerase chain reaction，QRT-PCR）法檢測骨痂組織VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達量處死大鼠后取骨折位置骨痂組織50mg，Trizol法提取總RNA，逆轉錄得cDNA，鑒定后進行基因序列擴增，按照QRT-PCR SYBRⅡ試劑盒說明書設定反應體系，反應體系總共25μL，包括SYBR Premix Ex Taq 10.5μL，5μmol·L-1上、 下游引物各1μL，cDNA 2μL，ddH2O 10.5μL。反應條件：90℃預變性5min，95℃變性20s，55℃退火40s，72℃延伸60s，重復40個循環，72℃延伸5min。以β-actin為內參基因，采用2-△△CT法計算各目的基因相對表達量。所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.7 Western blot法檢測骨痂組織VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達量 處死大鼠后取骨折位置骨痂組織50mg，充分研磨后冰上裂解30min，8 000r/min離心15min（離心半徑10cm），BCA法測定蛋白濃度，取30μg待檢測樣本與等體積上樣緩沖液混合，沸水浴5min，8 000r/min離心30min（離心半徑10cm），取上清液，SDSPAGE分離后轉膜，5%脫脂奶粉封閉2h，加入稀釋倍數為1:1 000的兔抗大鼠VEGF、VEGFR-2單抗稀釋液，4℃搖床孵育過夜，TBST洗滌3次，加入稀釋倍數為1:8 000的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2h，TBST洗滌3次后加入發光液，暗室顯影，凝膠成像系統掃描分析條帶灰度值，以目的條帶/內參條帶灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.4 統計學分析 應用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，多樣本資料組間比較采用單因素方差分析及重復測量方差分析，經Levene檢驗滿足方差齊性者，采用單因素方差分析，以最小顯著性差異（least significant difference，LSD）-t檢驗行兩兩比較；方差不齊者，采用Welch檢驗，再以Dunnett T3檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 干預第7、14、21天各組活體Micro-CT結果比較 干預第7、14、21天，各組間總體比較，BV/TV、Tb.N差異有統計學意義 （P＜0.01）。與對照組比較，ICA低劑量組、ICA高劑量組、陽性藥物組BV/TV更高，Tb.N更多（P＜0.05）；與ICA低劑量組比較，ICA高劑量組、陽性藥物組BV/TV更高，Tb.N更多（P＜0.05）；與ICA高劑量組比較，陽性藥物組BV/TV更高，Tb.N更多（P＜0.05）。隨時間延長各組BV/TV均呈增高趨勢，Tb.N呈增多趨勢（P＜0.01）。見表2～3。干預第21天活體Micro-CT結果顯示，對照組、ICA低劑量組骨折斷端尚未完全吻合，骨折線明顯，骨皮質外觀連續性差，提示新生骨量較少；ICA高劑量組、陽性藥物組骨折斷端吻合良好，骨折線不明顯，骨皮質外觀較為連續，提示新生骨量較多。見圖1。

圖1 干預第21天活體Micro-CT結果Fig.1 In vivo micro-CT results on the 21st day of intervention

表2 干預第7、14、21天各組BV/TV值比較（±s）Tab.2 Comparison of BV/TV value on the 7th，14th and 21st day of intervention in each group（±s）

表2 干預第7、14、21天各組BV/TV值比較（±s）Tab.2 Comparison of BV/TV value on the 7th，14th and 21st day of intervention in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ICA低劑量組比較，#P＜0.05；與ICA高劑量組比較，△P＜0.05；與同組第7天比較，▽P＜0.05；與同組第14天比較，◇P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05;compared with the same group on the 7th day，▽P＜0.05;compared with the same group on the 14th day，◇P＜0.05

組別 n 第7天 第14天 第21天對照組 10 0.19±0.04 0.24±0.05▽ 0.29±0.04▽◇ICA 低劑量組 10 0.24±0.05* 0.29±0.05*▽ 0.34±0.06*▽◇ICA 高劑量組 10 0.28±0.04*# 0.34±0.05*#▽ 0.40±0.05*#▽◇陽性藥物組 11 0.34±0.05*#△ 0.39±0.04*#△▽ 0.46±0.07*#△▽◇F 值 F 組間=15.246，F 時間=19.712，F 交互=17.075 P 值 P 組間＜0.01，P 時間＜0.01，P 交互＜0.01

表3 干預第7、14、21天各組Tb.N比較（±s，1·mm-1）Tab.3 Comparison of Tb.N on the 7th，14th and 21st day of intervention in each group（±s，1·mm-1）

表3 干預第7、14、21天各組Tb.N比較（±s，1·mm-1）Tab.3 Comparison of Tb.N on the 7th，14th and 21st day of intervention in each group（±s，1·mm-1）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ICA低劑量組比較，#P＜0.05；與ICA高劑量組比較，△P＜0.05；與同組第7天比較，▽P＜0.05；與同組第14天比較，◇P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05;compared with the same group on the 7th day，▽P＜0.05;compared with the same group on the 14th day，◇P＜0.05

組別 n 第7天 第14天 第21天對照組 10 1.87±0.32 2.25±0.46▽ 2.69±0.39▽◇ICA 低劑量組 10 2.22±0.37* 2.65±0.40*▽ 3.08±0.41*▽◇ICA 高劑量組 10 2.70±0.39*# 3.10±0.43*#▽ 3.54±0.55*#▽◇陽性藥物組 11 3.25±0.39*#△ 3.63±0.42*#△▽ 4.21±0.81*#△▽◇F 值 F 組間=10.711，F 時間=14.482，F 交互=12.270 P 值 P 組間＜0.01，P 時間＜0.01，P 交互＜0.01

2.2 各組生物力學測試結果比較 各組間總體比較，最大載荷差異有統計學意義（P＜0.01）。與對照組比較，ICA低劑量組、ICA高劑量組、陽性藥物組最大載荷更大（P＜0.05）；與ICA低劑量組比較，ICA高劑量組、陽性藥物組最大載荷更大（P＜0.05）；與ICA高劑量組比較，陽性藥物組最大載荷更大（P＜0.05）。見表4。

表4 各組生物力學測試結果比較（±s，N）Tab.4 Comparison of biomechanical test results in each group（±s，N）

表4 各組生物力學測試結果比較（±s，N）Tab.4 Comparison of biomechanical test results in each group（±s，N）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ICA低劑量組比較，#P＜0.05；與ICA高劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05

組別n最大載荷對照組 10 27.38±3.96 ICA低劑量組 10 36.92±5.07*ICA高劑量組 10 48.63±5.92*#陽性藥物組 11 59.87±7.03*#△F值 62.125 P值 ＜0.01

2.3 各組新生血管數量、新生血管面積比較 各組間總體比較，新生血管數量、新生血管面積差異有統計學意義（P＜0.01）。與對照組比較，ICA低劑量組、ICA高劑量組、陽性藥物組新生血管數量更多，新生血管面積更大（P＜0.05）；與ICA低劑量組比較，ICA高劑量組、陽性藥物組新生血管數量更多，新生血管面積更大（P＜0.05）；與ICA高劑量組比較，陽性藥物組新生血管數量更多，新生血管面積更大（P＜0.05）。見表5、圖2。

圖2 各組血管新生情況（HE染色，200×）Fig.2 Angiogenesis in each group（HE staining，200×）

表5 各組新生血管數量、新生血管面積比較（±s）Tab.5 Comparison of the number and the area of new blood vessels in each group(±s）

表5 各組新生血管數量、新生血管面積比較（±s）Tab.5 Comparison of the number and the area of new blood vessels in each group(±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ICA低劑量組比較，#P＜0.05；與ICA高劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05

組別 n 新生血管數量（個/視野） 新生血管面積（μm2/視野）對照組 10 5.10±0.83 1 652.30±324.87 ICA 低劑量組 10 9.00±1.53* 3 567.90±587.21*ICA 高劑量組 10 11.50±2.86*# 6 092.10±896.30*#陽性藥物組 11 16.80±3.52*#△ 8 847.30±1 246.35*#△F值 41.594 141.008 P 值 ＜0.01 ＜0.01

2.4 各組骨痂組織VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達量比較 各組間總體比較，骨痂組織VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達量差異有統計學意義（P＜0.01）。與對照組比較，ICA低劑量組、ICA高劑量組、陽性藥物組VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達量較高（P＜0.05）；與ICA低劑量組比較，ICA高劑量組、陽性藥物組VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達量較高 （P＜0.05）；與ICA高劑量組比較，陽性藥物組VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達量較高（P＜0.05）。見表6。

表6 各組骨痂組織VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達量比較（±s）Tab.6 Comparison of relative expression content of VEGF and VEGFR-2 mRNA in callus tissue in each group（±s）

表6 各組骨痂組織VEGF、VEGFR-2 mRNA相對表達量比較（±s）Tab.6 Comparison of relative expression content of VEGF and VEGFR-2 mRNA in callus tissue in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ICA低劑量組比較，#P＜0.05；與ICA高劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05

組別 n VEGF VEGFR-2對照組 10 0.18±0.03 0.19±0.03 ICA 低劑量組 10 0.30±0.05* 0.38±0.05*ICA 高劑量組 10 0.49±0.06*# 0.54±0.06*#陽性藥物組 11 0.68±0.07*#△ 0.70±0.08*#△F值 166.562 144.748 P 值 ＜0.01 ＜0.01

2.5 各組骨痂組織VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達量比較 各組間總體比較，骨痂組織VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達量差異有統計學意義（P＜0.01）。與對照組比較，ICA低劑量組、ICA高劑量組、陽性藥物組VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達量較高（P＜0.05）；與ICA低劑量組比較，ICA高劑量組、陽性藥物組VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達量較高（P＜0.05）；與ICA高劑量組比較，陽性藥物組VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達量較高（P＜0.05）。見表7、圖3。

圖3 各組骨痂組織VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達量Fig.3 Relative expression contents of VEGF and VEGFR-2 proteins in callus tissue in each group

表7 各組骨痂組織VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達量比較（±s）Tab.7 Comparison of relative expression contents of VEGF and VEGFR-2 protein in callus tissue in each group（±s）

表7 各組骨痂組織VEGF、VEGFR-2蛋白相對表達量比較（±s）Tab.7 Comparison of relative expression contents of VEGF and VEGFR-2 protein in callus tissue in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與ICA低劑量組比較，#P＜0.05；與ICA高劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with control group，*P＜0.05;compared with ICA low-dose group，#P＜0.05;compared with ICA high-dose group，△P＜0.05

組別 n VEGF VEGFR-2對照組 10 0.12±0.03 0.10±0.02 ICA 低劑量組 10 0.29±0.04* 0.23±0.03*ICA 高劑量組 10 0.51±0.06*# 0.52±0.07*#陽性藥物組 11 0.73±0.08*#△ 0.63±0.08*#△F值 228.939 194.775 P 值 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

骨折時，骨折斷端與臨近骨膜、血管受損，導致局部范圍骨壞死。當骨折正確固定后，斷端張力降低，斷端破骨細胞開始管性吸收，形成新的Haversian管系統，為血管內皮細胞、血管周干細胞、成骨前體細胞、成骨細胞以及新生血管進入骨痂創造條件，從而促進軟骨骨痂吸收、骨性骨痂形成、骨改建，實現骨折愈合[9-10]。骨折愈合是生物學、內分泌學、組織學、生物力學綜合作用的動態過程，需要血管發生與骨發生之間精密、協調地配合，其中血管發生先于骨發生，而且是軟骨成骨時期最為關鍵的環節[11]。因此，探尋安全、有效的促血管新生藥物對加快骨折愈合至關重要。

本研究結果顯示，與對照組比較，ICA低劑量組、ICA高劑量組、陽性藥物組的BV/TV、新生血管面積、最大載荷均增大，Tb.N、新生血管數量均增加，提示ICA可增加新生骨量、促進血管新生，加快骨折愈合，并增強其抵抗外力沖擊的能力。中醫認為，骨折后肢體經絡受損，血溢脈外，淤血不散，致經脈受阻、筋骨失養，骨折難愈[12]。腎主骨與髓，腎強則達骨和，淤散則達血新，筋骨得以濡養，氣血旺盛，則骨愈合。淫羊藿味辛、甘，歸于腎、肝經，具有補腎壯陽、祛風除濕、強健筋骨的功效。ICA是淫羊藿提取物中的主要有效成分，因其具有雌激素樣結構，逐漸被作為植物雌激素類藥物應用于抗骨質疏松治療[13]。既往研究顯示，ICA治療老齡大鼠骨質疏松骨折，可促使骨密度顯著回升，同時成骨標志蛋白表達明顯上調，提示ICA對該病具有良好的治療作用[14]。現代藥理學研究顯示，ICA可增強成骨細胞活性，同時促進類骨質鈣化與骨折位置的血管生成[15-16]。本研究應用不同劑量的ICA干預脛骨干骨折大鼠后，新生骨量及新生血管增加，抗沖擊能力增強，與ICA促進成骨細胞分化、血管生成等功效關系密切。

VEGF是一種具有特異性的強力血管新生誘導劑，可活化成纖維細胞，并促使其分泌基質，促進血管內皮細胞增殖、遷移，誘導血管生成。VEGFR-2是介導血管新生的重要信號傳遞分子，VEGF可與其結合，刺激血管內皮釋放基質蛋白降解酶，誘導內皮細胞游離，促進血管新生。同時VEGFR-2有助于提升內皮細胞增殖、遷移能力，還參與血管通透性的調節，在骨折愈合早期即能夠促使骨祖細胞聚集到骨折斷端，加快骨愈合速度，而其他相關因子對血管新生的促進作用也全部或部分通過VEGF而實現[17]。Liu等[18]研究發現，腫瘤細胞中VEGF/VEGFR-2表達顯著升高，VEGF/VEGFR-2信號通路抑制劑Apatinib可阻斷該信號通路，從而抑制腫瘤血管生成。安曉暉等[19]采用穿山龍總皂苷治療去勢大鼠骨折時發現，大鼠骨痂處骨密度及新生血管數量均增加，且VEGF、VEGFR-2蛋白表達均上調，提示VEGF/VEGFR-2信號通路與骨折愈合相關。本研究結果顯示，對照組、ICA低劑量組、ICA高劑量組、陽性藥物組VEGF、VEGFR-2 mRNA及蛋白相對表達量依次升高，提示ICA對大鼠脛骨干骨折愈合的促進作用可能與激活VEGF/VEGFR-2信號通路有關。

綜上所述，ICA可加快脛骨干骨折大鼠骨量新生，促進血管形成，增強抵抗外力沖擊的能力，且其作用呈劑量依賴性，推測其作用機制與上調VEGF、VEGFR-2表達，激活VEGF/VEGFR-2信號通路有關。本研究結果為ICA應用于骨折治療提供了理論基礎，然而關于ICA對脛骨干骨折是否存在其他影響及相關機制仍需進一步探討。