5個轉Bt基因抗蟲水稻恢復系的品質配合力分析

陳種凱,宋麗艷*,王 鑫,孫 玥,李 雙,王春雷,周大虎,歐陽林娟,賀曉鵬,傅軍如,陳小榮,朱昌蘭,賀浩華**,彭小松**

(1.作物生理生態與遺傳育種教育部重點實驗室/江西省超級稻工程技術研究中心/雙季稻現代化生產協同創新中心/江西農業大學 農學院,江西 南昌 330045;2.江西天涯種業有限公司,江西 萍鄉 337000)

國以農為本,農以種為先,以稻米為主食的人口占全世界人口的50%以上[1]。水稻綠色革命經歷了由半矮稈水稻到三系雜交稻再到兩系雜交稻的進程,推動水稻產量不斷攀高,為世界水稻生產和糧食安全做出了巨大的貢獻[2]。近幾年,隨著物質生活水平的提高,人們慢慢開始越來越關注大米的品質和口感,同時以高產雜交稻為主體的大米市場由于售價低,嚴重降低了農民種糧的積極性。選育米質優良的雜交稻新品種是當前水稻育種研究領域的新方向[1-3]。但雜交稻整體品質還是較常規稻略低,綜合前人的研究結果發現,主要在整精米率、堊白和蒸煮品質方面難以達標[4]。配合力分析經常被用于解釋水稻高產雜種優勢的遺傳基礎；基于經典數量遺傳學中的顯性、超顯性和上位性三大假說,最早研究者提出上位性是影響水稻產量形成的遺傳基礎[5,6]。后續研究表明顯性、超顯性和上位性均在不同程度上影響水稻的產量構成相關性狀[7-9]。稻米品質的遺傳基礎也可以通過配合力分析進行解析,親本一般配合力和組合特殊配合力的效應值對于稻米品質雜種優勢的利用具有關鍵的作用[10]。配合力作為反映親本對其后代性狀影響大小的指標,可有效衡量親本的利用價值,對于優良水稻種質資源的挖掘具有一定的參考意義。

轉基因水稻的研發在水稻抗蟲性的育種改良中具有里程碑式的作用,日本科學家Fujimoto等以粳稻作為中間受體材料，先將基因cry1Ab導入粳稻，最終將其導入了秈稻,是轉基因技術在水稻改良中的開端[11,12]。我國在水稻上發生的主要害蟲包括稻飛虱、螟蟲、稻癭蚊和稻薊馬等,抗蟲水稻的培育是抵御蟲害的重要措施之一[13,14]。1994年浙江大學首次利用農桿菌轉化法將cry1Ab基因導入秀水11中[15]。然而,在水稻品種的產量及稻米品質性狀上,轉基因抗蟲水稻的目標性狀較單一,選育品種的成果轉化與市場需求脫節,都是當前轉基因水稻發展亟需解決的問題[16-18]。

昌恢871、昌恢T025等水稻恢復系材料是江西農業大學獨立自主選育的材料,所配組合表現較好,尤其是昌恢871,與泰豐A配組的泰優871獲批為優質超級稻。通過配合力分析結合分子標記輔助選擇篩選抗蟲性好、配合力強、米質優良的轉基因水稻新品系,提高水稻品種間優良基因的疊加、互作及遺傳背景的相互滲透,對抗蟲水稻優質新品種的選育具有重要的意義[19-21]。本研究以5個轉Bt基因抗蟲水稻恢復系和12個不育系配制60個組合,對稻米的9個品質相關性狀進行配合力分析,比較了5個轉基因抗蟲恢復系的一般配合力大小,以期為親本材料的合理組配提供理論依據,為發掘具有優良米質且遺傳穩定的雜交稻組合以及選育優質雜交稻提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 轉基因恢復系 昌恢871T、昌恢881T、昌恢891T、昌恢T025T、昌恢121T,均由江西農業大學提供。

1.1.2 不育系 萬象A、原香39A、泰鄉1209A、武廣S、昌盛843A、野香A、廣泰A、荃9311A、紅蓮A、滬旱7A、華1165S、、五鄉A，由全國各科研單位與種業公司提供。

1.1.3 試劑 1.5×CTAB、氯仿/異戊醇(24∶1)、無水乙醇、引物(由上海生工公司合成)、Buffer、Taq酶、dNTP、瓊脂糖、GelRed等。

1.2 試驗方法

將5個轉基因水稻恢復系及12個不育系按NCII(5×12)設計,于2018年夏在江西農業大學轉基因試驗田進行雜交配組,并于2018年12月11日將F1播種于海南三亞江西農業大學南繁試驗基地,于2019年1月12日移栽。于2019年5月19日將F1在江西農業大學試驗田進行播種,并于同年6月21日進行移栽。釆用半干旱育秧。田間試驗按照隨機區組設計,每個小區栽插秧苗3行,每行10株,單本插秧；每個組合3個區組重復。

1.3 分子標記輔助檢測

利用CTAB法提取DNA。將DNA稀釋液進行PCR擴增,PCR反應程序為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,共35個循環;72 ℃ 5 min；于4 ℃保存。反應引物為cry1C-F:5'-GAAAGAATCGCTGAGTTCGC-3'；cry2A-R:5'-GAGGCTCCTGGTTAGCCTCT-3'。將PCR擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,以DNA Marker DL-2000為Marker,利用凝膠成像分析儀進行電泳結果檢測。

1.4 稻米品質性狀考察

稻米品質性狀的考察包括糙米率、精米率、整精米率、堊白粒率、長寬比、堊白度、膠稠度、堿消值、直鏈淀粉含量共9個性狀；在水稻完熟期收取500 g左右稻谷,曬干后留作實驗室檢測。

1.5 數據統計與分析

利用Excel和SPSS Statistics 17.0進行數據整理、方差分析，以及一般配合力(GCA)效應值、特殊配合力(SCA)效應值、基因型方差貢獻率、廣義遺傳率、狹義遺傳率的計算。統計分析方法參照不完全雙列雜交的配合力分析方法。利用Photoshop 2020軟件進行電泳膠圖處理。

2 結果與分析

2.1 cry1C的分子標記輔助選擇

對分蘗期葉片DNA中的cry1C進行PCR擴增,進行分子標記輔助檢測。瓊脂糖凝膠電泳結果(圖1)顯示，60個F1組合均能擴增出片段長度為600 bp的cry1C,因此F1代雜交組合均為抗蟲陽性單株。

M表示Marker;P表示供體親本明恢63;N表示受體親本(輪回親本);1～60表示轉Bt基因抗蟲雜交水稻組合。

2.2 配合力方差分析

對60個組合的稻米品質性狀進行方差分析，結果(表1)表明,每個組合中9個稻米品質性狀方差均達到了顯著水平,說明這9個稻米品質性狀均存在顯著的遺傳差異。除了堿消值影響的父本一般配合力方差外,其余各性狀的父本和母本的一般配合力方差和親本的特殊配合力方差均存在顯著性差異,表明父本和母本的基因加性效應以及父母本間的基因互作效應對于稻米品質性狀起著關鍵的作用。所有性狀的一般配合力方差均大于組合的特殊配合力方差,表明基因的加性效應對于稻米品質的影響更大。各種性狀的環境配合力方差結果顯示,只有整精米率、長寬比和直鏈淀粉含量的配合力方差未達到顯著水平,說明這3個性狀主要受遺傳因素的影響,環境對于它們的影響較小;堊白度和膠稠度的環境配合力方差均大于一般配合力方差和特殊配合力方差,說明環境對這兩個性狀的影響較大。

2.3 親本的一般配合力效應分析

在三亞地區,根據各親本的稻米品質性狀的一般配合力(GCA)分析可知,相同性狀的不同親本和同一親本不同性狀間的一般配合力存在較大差異,如表2所示。在不育系中,五鄉A的糙米率GCA效應值較好,為0.02。精米率表現較好的為泰鄉1209A、武廣S和五鄉A,GCA效應值均為0.02。原香39A、野香A和荃9311A的整精米率GCA效應值最高，均為0.02。萬象A的長寬比GCA效應值最高，為0.25。堊白粒率最低的為華1165S,GCA效應值為-0.09；其次為萬象A,效應值為-0.07。堊白度最低的是華1165S，其次為昌盛843A,效應值分別為-3.27、-3.08。堿消值的GCA效應值較好的有野香A、泰鄉1209A和武廣S,分別為0.67、0.57和0.57。膠稠度的GCA效應值適中的親本主要有野香A和荃9311A,分別為0.86和0.04。直鏈淀粉含量的GCA效應值較好的是原香39A，為-1.22。在恢復系中,昌恢T025T在糙米率上的GCA效應值最好，為0.01；其次為昌恢871T、昌恢881T、昌恢121T，均為0.01；糙米率最低的是昌恢891T。昌恢891T和昌恢T025T在精米率上的GCA效應值最好，為0.01；其次為昌恢881T、昌恢121T，均為0.01；精米率最低的是昌恢871T。昌恢891T、昌恢121T在整精米率上的GCA效應值最好，均為0.01；其他從高到低依次為昌恢121T、昌恢871T、昌恢881T。稻米長寬比的GCA效應值最高的是昌恢881T,最低的是昌恢891T。堊白粒率和堊白度是評價稻米外觀品質的兩個最重要的指標,堊白粒率和堊白度的GCA效應值最低的是昌恢871T,分別為-0.05和-3.55。昌恢121T的堿消值GCA效應值最高，為0.42；昌恢871T的堿消值效應值最低，為-0.49。膠稠度和直鏈淀粉含量對于稻米蒸煮品質及軟硬度最為重要,膠稠度的GCA效應值以昌恢891T最高,達到了2.97；膠稠度的GCA效應值以昌恢T025T最低，只有-3.20；昌恢871T的膠稠度效應值最為適中，為2.45。直鏈淀粉含量的GCA效應值以昌恢881T最高,達到1.35；以昌恢891T最低，只有-1.82。綜合產量相關性狀的GCA效應值可知,昌恢871T表現最好,其次為昌恢891、昌恢T025、昌恢121,而昌恢881表現最差。

表1 9個稻米品質性狀的配合力方差分析結果

綜上所述,恢復系的堊白粒率和堊白度的一般配合力普遍較低,膠稠度普遍較高,直鏈淀粉含量普遍適中。在轉Bt基因抗蟲恢復系的選育過程中,堊白粒率、堊白度、膠稠度和直鏈淀粉含量是主要的考核指標。

表2 在三亞地區各親本品質性狀的一般配合力(GCA)效應值

在南昌地區,相同性狀的不同親本和同一親本不同性狀間的一般配合力存在較大差異,如表3所示。在不育系中,五鄉A的糙米率GCA效應值最高，為0.02;精米率表現較好的為萬象A,其GCA效應值為0.02。原香39A的整精米率GCA效應值最高，為0.03。萬象A的長寬比GCA效應值最高，為0.28。堊白粒率GCA效應值最低的為華1165S,為-0.09；其次為萬象A,效應值為-0.04。堊白度GCA效應值最低的是昌盛843A,為-2.53；其次為昌盛843A,效應值為-2.40。堿消值GCA效應值較好的有原香39A、野香A和荃9311A,分別為0.65、0.42和0.37。膠稠度的GCA效應值以昌盛843A和野香A較好,分別為3.54和1.07。直鏈淀粉含量的GCA效應值較好的是原香39A，為-1.18。在恢復系中,昌恢T025T在糙米率上的GCA效應值為0.00；糙米率GCA效應值最低的是昌恢121T。昌恢871T和昌恢891T在精米率上的GCA效應值最高，均為0.01；最低的是昌恢T025T和昌恢121T，均為-0.01。昌恢891T在整精米率上的GCA效應值最高，為0.03。稻米長寬比GCA效應值最高的是昌恢881T，為0.17。堊白粒率和堊白度的GCA效應值最低的分別是昌恢871T和昌恢121T,分別為-0.06和-0.97。昌恢871T的堿消值效應值最高，為0.39。膠稠度的GCA效應值以昌恢891T最高,達到7.54；以昌恢871T最低，只有-5.64；昌恢881T的膠稠度效應值最為適中，為1.38。直鏈淀粉含量的GCA效應值以昌恢881T最高,達到1.04；最低為昌恢891T，只有-1.74。

綜合評價三亞地區和南昌地區各稻米品質性狀的GCA效應值,昌恢871T和昌恢891T表現較好,但昌恢871T的膠稠度GCA效應值受環境影響大,昌恢891T的堊白粒率和堊白度GCA效應值均偏高。

表3 在南昌地區各親本品質性狀的一般配合力(GCA)效應值

2.4 組合的特殊配合力比較

在三亞地區,對60個組合的各稻米品質性狀進行特殊配合力(SCA)效應值分析。由表4可知,在大米研磨品質性狀上,糙米率SCA效應值最高的組合為萬象A/昌恢T025T,SCA效應值為0.04。精米率SCA效應值最高的組合為紅蓮A/昌恢T025T,SCA效應值為0.07；其次為華1165S/昌恢891T,SCA效應值為0.05。整精米率SCA效應值最高的組合為武廣S/昌恢T025T,SCA效應值為0.10；最低的組合為五鄉A/昌恢121T,SCA效應值為-0.11。在大米外觀品質性狀上,長寬比的SCA效應值變異范圍在-0.54～0.60,表現為負的共有35個組合,其中原香39A/昌恢871T、泰鄉1209A/昌恢T025T的長寬比效應值最低,均為-0.54。堊白粒率和堊白度以泰鄉1209A/昌恢T025T表現最好,SCA效應值分別為-0.10和-7.06；以武廣S/昌恢T025T表現最差,SCA效應值分別為0.10和8.12。在大米蒸煮品質性狀上,堿消值SCA效應值最高的為昌盛843A/昌恢T025T,效應值為1.84；最低的為泰鄉1209A/昌恢T025T,效應值為-2.20。膠稠度的SCA效應值以原香39A/昌恢891T最高,達到22.58；以昌盛843A/昌恢871T最低，只有-28.25。直鏈淀粉含量的SCA效應值以滬旱7A/昌恢891T最高,達到4.17；以原香39A/昌恢891T最低，只有-3.56。綜合稻米品質性狀的SCA效應值可知,原香39A/昌恢891T表現最好,其次為泰鄉1209A/昌恢T025T、昌盛843A/昌恢T025T。

表4 在三亞地區各組合稻米品質性狀的特殊配合力(SCA)效應值

續表4:

在南昌地區,對60個組合的各稻米品質性狀進行SCA效應值分析,由表5可知,在大米研磨品質性狀上,糙米率SCA效應值最高的組合為萬象A/昌恢891T,SCA效應值為0.03。精米率SCA效應值最高的組合為萬象A/昌恢891T,SCA效應值為0.06。整精米率SCA效應值最高的組合為原香39A/昌恢871T,SCA效應值為0.12；最低的組合為五鄉A/昌恢121T,SCA效應值為-0.11。在大米外觀品質上,長寬比的SCA效應值受遺傳背景的影響較大,其中武廣S/昌恢891T、荃9311A/昌恢871T的長寬比效應值較高,分別為0.68和0.60。堊白粒率和堊白度SCA效應值以原香39A/昌恢891T表現最好,SCA效應值分別為0.03和-7.11；以武廣S/昌恢T025T表現最差,SCA效應值分別為-0.09和7.17。在大米蒸煮品質上,堿消值SCA效應值最高的為昌盛843A/昌恢891T,效應值為1.74；SCA效應值最低的為昌盛843A/昌恢121T,效應值為-3.18。膠稠度的SCA效應值以荃9311A/昌恢T025T最高,達到29.89；以昌盛843A/昌恢T025T最低，只有-24.48。直鏈淀粉含量的SCA效應值以滬旱7A/昌恢891T最高,達到3.76；最低為昌盛843A/昌恢891T，其SCA效應值只有-3.70。

綜合三亞地區和南昌地區稻米品質性狀的SCA效應值可知,原香39A/昌恢891T、昌盛843A/昌恢891T表現較好,原香39A/昌恢891T各性狀的SCA效應值較穩定,受環境影響小;昌盛843A/昌恢891T的膠稠度SCA效應值在不同環境下變幅特別大,說明受環境影響較大。

表5 在南昌地區各組合稻米品質性狀的特殊配合力(SCA)效應值

續表5:

2.5 雜交組合遺傳參數分析

利用遺傳模型算式對9個稻米品質性狀進行基因型方差遺傳分量的估算,結果如表6所示。精米率的GCA基因型方差貢獻率在40%以上,說明其主要受基因加性效應的影響,在選育時應更多地關注親本一般配合力的大小;糙米率、整精米率、堊白粒率、堿消值和膠稠度的SCA基因型方差貢獻率達80%以上,說明它們主要受基因非加性效應互作的影響,在選育時應更多地關注組合特殊配合力的大小;長寬比的GCA、SCA基因型方差貢獻率相差不大,說明其主要受基因加性效應和基因非加性效應互作的共同影響。

母本在堿消值、膠稠度的基因型方差遠高于父本,而在堊白粒率、堊白度、直鏈淀粉含量上遠低于父本；雙親在糙米率、精米率、整精米率和長寬比上的基因型方差相近,表明雜交組合的堿消值、膠稠度的表現更多地由不育系決定,堊白粒率、堊白度、直鏈淀粉含量主要由恢復系決定,而糙米率、精米率、整精米率和長寬比要綜合考慮雙親的表現。

遺傳率是各性狀遺傳變異占總變異的百分比。表6中的遺傳率結果表明：堊白粒率、堊白度、膠稠度和直鏈淀粉含量的廣義遺傳率均較高,說明這些性狀主要受基因遺傳的影響,可在早代進行選擇；糙米率、精米率和堿消值的狹義遺傳率均較低,說明在加代過程中這些性狀的穩定性較差,易受環境和基因非加性效應的影響,對這些性狀較好的親本進行配組后,往往表現為性狀傳代過程中傳遞能力較差,故盡可能在晚代選擇或者間接選擇。

表6 雜交組合遺傳參數分析結果

3 討論

品質性狀是農作物的重要性狀,分析稻米品質性狀有利于優質水稻組合的篩選。在本研究中，稻米的外觀品質和蒸煮品質與季節互作明顯,表明其配合力的大小與不同生態環境密切相關,這與前人[22,23]的研究結果“配合力在不同的生態區表現不一致”相似。就本試驗的堿消值、膠稠度等性狀而言,不育系的一般配合力方差貢獻率高,該研究結果與膠稠度的選擇側重于不育系的結果[24]一致。在堊白粒率、堊白度、直鏈淀粉含量性狀上,恢復系的一般配合力方差貢獻率高,前人的研究結果也表明堊白粒率、堊白度的選擇側重于恢復系的表型[25]。糙米率、精米率和堿消值受環境影響較大,而前人通過狹義遺傳率計算模型研究表明堊白度和直鏈淀粉含量受環境影響較大,說明不同品種稻米品質性狀的遺傳力也不同[26,27]。前人的研究表明稻米品質性狀的一般配合力與特殊配合力沒有較高的相關性[28,29]；本研究也發現親本的一般配合力與其所配組合的特殊配合力相互獨立,這與前人的研究結果相符。稻米品質性狀表現更多地受基因非加性效應互作的影響,因而應該更多地觀測雜交后代的特殊配合力效應值。

4 結論

通過分析17個親本間的配合力效應和遺傳特點,在恢復系中,昌恢871T和昌恢891T表現較好,但昌恢871T的膠稠度GCA效應值受環境影響大,昌恢891T的堊白粒率和堊白度GCA效應值均偏高;在不育系中,華1165S的堊白粒率和堊白度較低,野香A的堿消值和膠稠度較好,而原香39A的直鏈淀粉含量最低。在雜交組合中，原香39A/昌恢891T、昌盛843A/昌恢891T的綜合表現最好,其中原香39A/昌恢891T 的各性狀受環境影響小,而昌盛843A/昌恢891T的膠稠度受環境影響較大。精米率主要受基因加性效應的影響,糙米率、整精米率、堊白粒率、堿消值和膠稠度主要受基因非加性效應互作的影響。本試驗中雜交組合的堿消值、膠稠度的表現更多地依賴于母本,堊白粒率、堊白度、直鏈淀粉含量主要受父本的影響,糙米率、精米率、整精米率和長寬比取決于雙親的綜合表現。堊白粒率、堊白度、膠稠度和直鏈淀粉含量主要受基因遺傳的影響,糙米率、精米率和堿消值在后代遺傳中的穩定性較差,易受環境和基因非加性效應的影響。

綜上所述,優質雜交稻的選育應采用高精米率的親本,同時側重于堿消值、膠稠度較高的母本,堊白粒率、堊白度、直鏈淀粉含量為低表型值的父本；在選用糙米率和堿消值較高的親本選育優質雜交稻時,要注重F1代的特殊配合力，以及生態環境、病蟲害發生和栽培環境的影響,同時結合分子標記輔助選擇降低基因cry1C在傳代過程中丟失的概率,篩選出優良抗蟲雜交組合。因此,在本試驗中配制高產組合的最佳不育系為華1165S,最佳恢復系為昌恢891T。稻米品質性狀最優的組合為原香39A/昌恢891T,其堊白粒率和堊白度均為最優,膠稠度和直鏈淀粉含量也較好,且受環境影響小;泰鄉1209A/昌恢T025T、昌盛843A/昌恢T025T和昌盛843A/昌恢891T在堊白度、膠稠度及直鏈淀粉含量上的表現也較好。