采用花粉管通道法遺傳轉化月季石榴的研究

唐麗穎,陳利娜,敬 丹,駱 翔,李好先,曹尚銀

(中國農業科學院 鄭州果樹研究所,河南 鄭州 450009)

石榴(PunicagranatumL.),其原產地為俄羅斯、伊朗、土耳其、阿富汗和高加索等中亞、西亞地區,目前在全世界范圍內廣泛種植[1]。石榴在我國有2000多年的栽培歷史,有“天下之奇樹,九洲之名果”的美稱[2]。長久以來,石榴因用途廣泛、形態美觀而受到人們的喜愛,其集食用、藥用、經濟、觀賞、生態價值于一身,在我國被視為重要的經濟林樹種。目前我國除極寒冷地區外均有石榴分布,逐漸形成了幾大石榴產區。近些年,石榴栽培的經濟效益顯著,已經成為許多地區脫貧致富奔小康的特色產業。截至2013年,我國石榴栽培面積約12萬hm2,年產量120萬t[3]。2017年,國內石榴總產量達169.71萬t,石榴產品的需求量有167.90萬t,同比增長13.1%[4]。

因石榴起源于中亞、西亞地區,喜溫畏寒,適宜栽植于氣候溫暖的地區,就我國而言,淮河以北的石榴栽培區易發生凍害。石榴可以耐-16 ℃以上的低溫,在-17 ℃下會發生凍害,在-20 ℃下會死亡。栽植廣泛的‘突尼斯軟籽’石榴在-10 ℃低溫環境中超過12 h就會被凍傷[5]。2002年,山東省濟寧市任城區長溝鎮二年生5.3 hm2石榴凍死株率達70%以上[6];同年,陜西臨潼地區絕對低溫為-12.9 ℃,石榴樹普遍發生了凍害[7]；2002年，山東東明降雪及持續低溫6 d,最低氣溫達-13 ℃,400 hm2石榴受凍率達100%[8];2009年,安徽淮北發生“倒春寒”，導致約6667 hm2的栽培石榴受凍率達90%以上[9]；2009年，河南滎陽遭遇寒潮侵襲,‘突尼斯軟籽’石榴約90%被凍死[10];山東棗莊石榴產區于2010～2015年間幾次遭受凍害,其中2012～2013年凍害發生率為37.2%,2015年有70%～80%的石榴受凍害而死[12]。如此嚴重的凍害,常使產生經濟效益的石榴樹被凍死,給果農造成了極大的經濟損失,嚴重打擊了果農種植石榴的熱情與信心。石榴凍害已經嚴重制約了我國石榴生產、育種、研究等相關工作的開展,阻礙了石榴產業在我國的發展,培育抗凍軟籽石榴新品種可以為我國石榴產業發展提供新的思路及方向。

石榴品種選育的方法主要包括引種、實生選種、芽變選種、雜交育種、遠緣雜交育種、誘變育種、倍性育種、轉基因育種[3]。目前,雜交育種仍是果樹育種中應用較為廣泛且有效的途徑,按照常規雜交育種的方式,將遺傳基礎不同的品種進行人工授粉受精,再經過6～8代的回交和繁瑣的背景選擇,最終從后代中選擇出具有優良性狀的新品種,對于果樹來說育種周期較長,育種效率較低。因此轉基因育種已經逐漸成為新品種培育的重要手段。許多植物利用轉基因技術育種獲得了顯著效果,例如：利用轉錄后基因沉默的現象,將番木瓜最主要的病毒病——環斑病的復制酶基因轉入番木瓜基因組中,培育成抗環斑病的轉基因番木瓜新品種“華農一號”[13];利用轉基因技術提高了大豆的耐旱、耐鹽、耐熱性等[14],進而提高了大豆的品質與產量;用轉基因技術培育出了抗旱抗病抗蟲的棉花新品種,其中抗蟲棉的培育與普及不僅減輕了棉鈴蟲的危害,還給農民帶來了直接收入[15]。常見的植物轉基因技術主要包括農桿菌介導轉化法[16]、基因槍法[17]、花粉管通道法[18]、顯微注射法[19]、電激法[20]等。目前較為常用的方法是農桿菌介導轉化法和花粉管通道法。農桿菌Ti質粒基因轉化法被廣泛應用于雙子葉植物中,截至2014年,有80%以上的轉基因植株是利用根癌農桿菌轉化系統產生的[21]。通過對根癌農桿菌Ti質粒基因轉化法進行改進,使其用于果樹育種,適用性廣,木本植物也能通過此方法獲得轉化的植物細胞。發根農桿菌介導的植物轉化法被廣泛應用于生根困難的植物中,例如武姣等以山定子組培苗植株為試驗材料,用發根農桿菌誘導產生發根,并由新發根獲得了再生植株[22]。

我國科學家周光宇于1983年首次提出了花粉管通道法[23]。此后人們對花粉管通道法進行了大量的研究,包括外源基因轉化機理、轉化技術、轉化后代的性狀鑒定等,這項技術也逐漸被應用到育種工作中。近些年來,花粉管通道法已經成功地被應用于棉花、玉米、水稻、大豆等作物的育種工作中，例如：利用花粉管通道法將合成的Bt基因導入棉花優良品種,獲得了轉基因植株,形成了抗蟲棉群體[24];王罡等利用花粉管通道法將Bt毒蛋白基因轉入玉米自交系,為抗蟲育種提供了優良抗源[25];王才林等采用花粉管通道法,將bar基因導入水稻,在142個后代植株中獲得了4個轉bar基因植株,在T3代形成了抗除草劑的穩定株系[26];將外源半野生大豆的總DNA經花粉管通道法直接導入栽培大豆,育成了高產、優質的大豆新品種黑生101[27]。

農桿菌介導法是目前果樹轉基因育種中應用較廣泛的方法,也是石榴轉基因育種中普遍使用的手段。Terakami等以矮化石榴葉片和莖段為外植體進行農桿菌介導的遺傳轉化,將NPTⅡ新霉素磷酸轉移酶基因及綠色熒光蛋白基因GFP導入了石榴基因組[28]。郭曉麗以突尼斯軟籽石榴的愈傷組織作為外植體,用農桿菌介導法轉化抗寒基因,得到了轉化植株[29]。Verma等用農桿菌介導法轉化抗蟲基因[Cry1A(b)]和NPTⅡ,成功獲得了轉化植株[30]。農桿菌介導技術發展至今,雖取得了一定的進展,但仍存在遺傳轉化體系不完善、轉化效率低等問題[31]。

我們將花粉管通道法與農桿菌介導法結合,將月季石榴的花柱浸泡在含有PgLCBF1目的基因的農桿菌菌液中,利用該植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道將外源基因導入受精卵細胞,并進一步整合到受體細胞的基因組中,最后隨著受精卵的發育而獲得了含有抗寒基因PgLCBF1的抗寒石榴新品種。本研究的目的是為育種周期較短、效率較高的石榴轉基因育種方法的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 供試材料為中國農業科學院鄭州果樹研究所干果課題組試驗基地中當年開花的月季石榴實生苗,采用常規栽培管理方法進行管理。選擇連接pBI121載體的PgLCBF1基因對月季石榴進行遺傳轉化。

1.1.2 菌株和質粒 感受態細胞Trans-T1；農桿菌菌株GV3101;試驗所用的PgLCBF1基因質粒由本實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 觀察花粉管的萌發情況

1.2.1.1 采集花粉 摘取花粉成熟的鐘狀花,去掉花瓣,待其自然陰干后,將兩花相對進行摩擦,收集落下的花粉。

1.2.1.2 授粉 用鉛筆的橡皮頭蘸取收集好的花粉,輕輕點涂在筒狀花花柱的柱頭上。

1.2.1.3 觀察花粉管的萌發 分別于授粉后24、32和48 h取花柱,先用FAA固定液固定24 h以上,再用2 mol/L的NaOH溶液在65 ℃恒溫箱中軟化處理7 h,待樣品為半透明狀后用清水沖洗,最后用0.1%水溶性苯胺藍溶液染色過夜[17]。使用OlympusDP71熒光顯微鏡觀察花柱中花粉管的萌發情況。

1.2.2 用熱激法轉化Trans-T1感受態細胞 取pBI121質粒5 μL，將其加入到50 μL處于冰水混合狀態的Trans-T1感受態細胞中,輕彈混勻,置于冰上30 min；42 ℃水浴熱激30 s,立即置于冰上2 min；加入250 μL液體LB無抗培養基,在200 r/min、37 ℃下培養1 h；取100 μL菌液，涂在含50 mg/L Kan的固體LB培養基上,37 ℃培養過夜。

1.2.3 表達載體PgLCBF1-pBI121的構建 挑取過夜培養的pBI121單菌落于含Kan的液體LB培養基中,在230 r/min、37 ℃條件下培養12 h，然后用質粒提取試劑盒(TIANGEN)提取菌液質粒；對質粒進行XbaⅠ酶切，酶切反應體系見表1；酶切完成后,用膠回收試劑盒回收酶切片段；將PgLCBF1目的片段連接到表達載體pBI121上,連接程序為25 ℃ 10 min；取連接反應體系(見表2)250 μL，涂在含Kan的固體培養基上,37 ℃培養過夜；挑取單菌落進行PCR，檢測目的片段與表達載體是否連接成功；在連接完成后轉化Trans-T1感受態細胞。

表1 酶切反應體系

表2 目的片段和表達載體連接反應體系

1.2.4 菌液的制備 把帶有PgLCBF1目的基因的農桿菌接種在YEP固體培養基(YEP+Kan 50 mg/L+Rif 25 mg/L)上，培養24～48 h；挑取單克隆,轉接到1 mL液體培養基(YEP+Kan 50 mg/L+Rif 25 mg/L)中,在230 r/min、28 ℃下培養24 h；利用菌液PCR方法鑒定出陽性單菌落后，按照1∶100的比例繼續在YEP+Kan 50 mg/L+Rif 25 mg/L液體培養基中擴大培養,在230 r/min、28 ℃下培養12 h左右,使OD600處于0.8～1.2的最佳范圍。將獲得的農桿菌菌液以4000 r/min在4 ℃下離心10 min,收集菌體,然后用重懸液將菌體重懸至OD600為0.8左右,置于冰上備用。重懸液配方為: MS+蔗糖5%+Silwet L-77 0.03%(體積分數)或蔗糖5%+Silwet L-77 0.03%(體積分數)。

1.2.5 浸染轉化 根據花粉管生長的熒光顯微觀察結果確定合適的轉化時機。選擇試驗樹上柱頭未開裂的筒狀花,將重懸好的農桿菌菌液倒入塑料盒中,浸沒筒狀花2 min；在花柄處涂抹赤霉素10 mg/L,套袋保濕24 h，并掛牌標記。浸染時針對浸染介質及授粉方式設計了4個不同的處理,如表3所示。采用花粉管通道法進行月季石榴遺傳轉化的流程見圖1。

表3 花粉管通道法設置的不同處理

1.2.6 轉基因植株的催芽播種 將獲得的石榴種子于4 ℃處理15～30 d；用清水搓洗表面果肉；用1 mol/L HCl浸泡15 min；用清水清洗5～6遍；用清水浸泡7 d左右,1～2 d換水1次,洗凈殘留果肉。

A為月季石榴當年開花；B為浸染花狀態；C為浸染后套袋保濕24 h；D為催芽后播種；E為獲得實生苗。

1.2.7 轉化植株的檢測 將獲得的實生苗以每100棵為一組混樣,進行GUS染色；將葉片浸沒染色液后使用真空泵抽氣至真空狀態并保持2 h,于37 ℃孵育12～24 h；最后用75%乙醇脫色后進行觀察,篩選出葉片顯藍色的組合。將篩選出的每個組合進行逐棵取樣,剪取轉基因植株莖尖附近1～2片嫩葉,采用磁珠法提取基因組總DNA。使用35s通用引物為上游引物,根據目的基因序列設計合成下游引物CBF1-R:5’-CTACCAAGTGGAGTGATTCCATA-3’。采用Vazyme高保真聚合酶2×Phanta Max Master Mix進行PCR擴增，PCR擴增體系見表4，擴增程序:95 ℃ 3 min; 95 ℃ 15 s,58 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共35個循環;72 ℃ 5 min;在4 ℃下暫存。將擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測,然后進行凝膠回收純化(TIANGEN,瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒)。對凝膠回收產物進行測序驗證,測序委托河南尚亞生物技術有限公司完成。

表4 PCR擴增體系

2 結果與分析

2.1 花粉管萌發情況

觀察發現,授粉后24 h花粉開始萌發,但并未伸長生長(圖2A)；授粉32 h和48 h時花粉管已伸到子房(圖2B、圖2C),因此推測選擇授粉后24 h進行菌液浸染可能使菌液深入到花粉管,進而提高轉化效率。

A：授粉后24 h花粉開始萌發,未到達子房。B：授粉后32 h花粉萌發,開始伸長。C：授粉后48 h花粉伸長至子房。

2.2 不同處理對轉化后石榴坐果率、出芽率、陽性率的影響

2.2.1 不同處理獲得的果實數、種子數及出芽數 在本試驗中,每處理浸染5朵花。由表5可知：處理Ⅰ收獲5個果實、811粒種子，其中338粒發芽,獲得了2株陽性植株,陽性率為0.25%;處理Ⅱ收獲5個果實、565粒種子，其中380粒發芽,獲得了10株陽性植株,陽性率為1.77%;處理Ⅲ收獲3個果實、520粒種子,其中346粒發芽,獲得了2株陽性植株,陽性率為0.38%;處理Ⅳ未收到果實。

表5 不同處理對轉化后石榴坐果率、出芽率、陽性率的影響

2.2.2 不同處理對坐果率的影響 從表6可以看出：當浸染介質為MS+5%蔗糖時,處理Ⅰ的坐果率為100%,處理Ⅲ的坐果率為60%;當浸染介質為5%蔗糖時,處理Ⅱ的坐果率為100%,處理Ⅳ未收到果實,說明在授粉后24 h浸染有助于提高坐果率，而浸染介質對坐果率的影響不大。

表6 不同處理的坐果率比較 %

2.2.3 不同處理對出芽率的影響 由表7可見：當浸染介質為MS+5%蔗糖時,處理Ⅰ的出芽率為41.68%,處理Ⅲ的出芽率為66.54%;當浸染介質為5%蔗糖時,處理Ⅱ的出芽率為67,26%,處理Ⅳ未收到果實，說明在浸染介質MS+5%蔗糖下,宜采用浸染時授粉方式，而在浸染介質5%蔗糖下,宜采用授粉后浸染方式。

表7 不同處理的出芽率比較 %

2.2.4 不同處理對陽性率的影響 如表8所示：當浸染介質為MS+5%蔗糖時,處理Ⅰ的陽性率為0.25%,處理Ⅲ的陽性率為0.38%,相差0.13個百分點;當浸染介質為5%蔗糖時,處理Ⅱ的陽性率為1.77%,說明授粉方式對陽性率影響不大，但采用浸染介質5%蔗糖有利于提高陽性率。

2.3 GUS染色及陽性植株的PCR檢測結果

對1819棵植株進行GUS染色,獲得了82棵顯藍色的待檢測植株。對這些待檢測植株進行逐棵取樣,提取DNA后進行PCR檢測,3次重復驗證,得到了14個可以擴增出目的基因的樣品(圖3～圖4),初步證明PgLCBF1基因已被整合到月季石榴的基因組中,獲得14棵轉基因月季石榴植株。進一步的表型觀察、抗性分析及遺傳穩定性等分析驗證工作正在進行中。

表8 不同處理的陽性率比較 %

3 討論與結論

迄今，石榴轉基因育種主要采用農桿菌介導法,存在轉化體系不完善、轉化效率低、再生率不高等問題。Terakami等利用農桿菌介導法成功地將目的基因轉入石榴基因組,證明農桿菌的感染能力與基因型、外植體類型有關,不同基因型、類型的外植體在相同條件下遺傳轉化時轉化率存在明顯差異[28]；連紅可初步建立了‘突尼斯軟籽’石榴的瞬時表達體系[32]；李躍霞的研究表明Kan和Glu的質量濃度對愈傷組織的形成影響較大,Cef的質量濃度對材料上雜菌的生長有不同程度的影響[8]。吳亞君經研究得出,用石榴組培苗的子葉為外植體進行遺傳轉化,在共培養3 d后未發生褐化,并且能誘導出抗性芽[33]。Verma等以石榴品種‘Kandhari Kabuli’的胚、子葉和莖段為外植體成功進行了遺傳轉化[30]。趙玉潔分別以石榴組培苗的子葉、葉片、上胚軸和下胚軸為外植體,進行了遺傳轉化試驗[34]。Verma等在進行農桿菌介導石榴轉化時雖成功獲得了轉化植株,但是轉化率僅為23.0%左右[30];郭曉麗[29]、吳亞君[33]及趙玉潔[34]在研究中雖然得到了抗性芽,但均未出現轉化苗生根的現象;楊選文等對石榴的遺傳轉化受體材料進行研究,篩選不同激素種類和濃度的初代培養基,經過多次繼代培養,篩選出穩定且無菌的石榴增殖培養基,得到了穩定健壯的葉片受體材料[35]。

M:DL2000 Marker。S1～S14:待測樣品(714 bp)。0:陰性對照。1:陽性對照(714 bp)。

圖4 膠回收產物測序結果與PgLCBF1序列對比

我國的科學家周光宇提出了花粉管通道法[36],采用該方法導入的DNA片段或目的基因易于整合,使目的基因所控制的性狀在受體植株中易于穩定[37]。花粉管通道法被認為是一種直接、簡單、有效的轉基因技術,有較廣闊的應用前景。目前花粉管通道法并不成熟,在植物中應用還不廣泛。花粉管通道法在小麥轉基因中的效率一般為0.2%～8.0%,也有人得到了30%的轉基因效率,但仍存在結實率與轉化率差異大、后代存在變異株系等問題[38]。王樹軍等首次將花粉管通道法應用于荔枝轉基因育種中,但轉化效果不理想[18]。許多研究表明,DNA導入時間及處理部位對結實率及轉化率都有影響，其中DNA導入時間較為重要,因為經花粉管進入胚囊的外源DNA能否成功參與受精是花粉管通道法轉化成功與否的關鍵。此外,溫度、濕度等因素也會影響花粉管通道法的轉化結果[38]。

本研究將花粉管通道法與農桿菌介導法結合起來，應用于月季石榴的遺傳轉化,利用自身的生殖系統作為載體,在遺傳轉化技術方面避免了繁瑣的組織培養與再生過程,直接通過花粉管通道轉化目的基因,并經PCR檢測,初步證明獲得了14棵轉基因陽性植株,這為拓展石榴遺傳轉化的途徑提供了新思路。同時,對花粉管的萌發情況進行觀察,確定在授粉后24 h進行轉化較為合適。針對4個不同處理,綜合比較坐果率、出芽率、陽性率等,發現“浸染介質為5%蔗糖,授粉方式為授粉后24 h浸染”的效果較好,這為后續研究、優化奠定了基礎。但該方法的轉化效率不理想,可能存在后代分離現象。我們以后擬進一步對所獲得的轉基因月季石榴陽性植株進行表型觀察、抗性分析，并在本試驗的基礎上不斷優化遺傳轉化體系,對不同的影響因素進行深入研究,以期建立簡單、高效、穩定的石榴花粉管通道法遺傳轉化技術體系。