分子即時檢驗(POCT)在病毒性呼吸道感染疾病診斷中的應用前景

劉 芳，牛亞倩，常鈺玲，宋艷梅，陳 徹，楚惠媛，李鵬杰

(甘肅中醫藥大學臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000)

近年來，病毒性呼吸道感染是引起全球感染性疾病中發病率和病死率較高的原因之一，其中包括甲型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠狀病毒等。分子即時檢驗(POCT，point-of-care testing)具有快速、準確、方便、可靠等優點，逐漸用于呼吸道病原體的診斷，可縮短患者住院時間，減少不必要的抗菌藥物使用，對于患者病情診療及預后具有重要意義。本文主要介紹病毒性呼吸道感染POCT的臨床應用現狀及前景，為臨床病毒性呼吸道感染診斷提供參考依據。

1 病毒性呼吸道感染疾病的現狀

呼吸道感染疾病是致病微生物侵入呼吸道進行繁殖，并引起相應癥狀的一類疾病[1]，病毒是急性呼吸道疾病中最常檢測到的病原體[2]。成人病毒性呼吸道感染疾病的住院率為(5～20)/100 000[3]，高齡患者甚至高達1 200/100 000，其中流感病毒會產生季節性流感，可導致住院人數激增并且容易引起老年人死亡[4]。此外，病毒性感染并發癥也通常可引起住院率和病死率增高，如肺炎、病毒性心肌炎、病毒性腦炎和潛在的心肺疾病惡化癥[5-6]。

常見的流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人間質肺病毒和冠狀病毒均會引起急性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘急性加重以及其他急性呼吸道疾病[7]。除急性呼吸性疾病外，病毒性呼吸道感染還可能表現為失代償心血管疾病、糖尿病緊急情況等[8]，導致大規模的住院治療，并給醫療保健系統帶來重大的負擔。而在呼吸道病毒的診治過程中，僅有少部分患者能被正確、快速診斷為某種病毒感染[9]。

2 POCT的概述

POCT具有即時檢驗、床旁檢驗、就地檢驗等含義，指臨床實驗室外，臨近或在患者護理現場直接進行標本檢測、分析，現也包括患者的家庭自我監測[10]。POCT能夠就近、快速地提供結果，醫務人員可以根據檢測結果盡快采取措施。經時間的推進和技術的發展，POCT快速檢測、方便攜帶、容易使用的特點對醫療、護理和實驗室工作人員都具有強大吸引力。

POCT關鍵驅動因素是樣本被送到臨床實驗室時可能會延遲臨床決策。有研究[11]評估POCT和臨床實驗室檢測的區別，對急診患者標本分別行上述兩種檢測，發現相比臨床實驗室檢測，POCT可縮短結果檢測時間和患者就診時間。POCT比臨床傳統實驗室檢測在時間上更具有優勢，且POCT的使用將減少部分臨床鑒別診斷和治療決策所用的時間，對患者預后具有重要意義。在當代社會，隨著POCT可檢測的項目不斷增多，質量的不斷進步，設備的不斷更新完善，其在呼吸道感染的診斷及治療中日益發揮重要作用。

3 病毒性呼吸道感染的檢測方法

病毒性呼吸道感染的檢測方法主要分為常規檢測和FilmArray呼吸道測試條檢測。常規病原檢測主要為分離培養、血清學、分子生物學等方法，結果可靠，但耗時較長，延遲臨床決策。近年來，新興設備利用分子技術，在足夠小的POCT設備中快速檢測呼吸道病原體，如FilmArray呼吸道測試條，其可靠性、實用性和準確度均能滿足臨床診斷，在提高病原體檢出率及患者個性化治療方面發揮重要作用。

3.1 常規檢測 流感快速診斷試驗和其他呼吸道病毒檢測一樣，均是基于抗原檢測鼻咽樣品，但是在成人檢測中其靈敏度僅50%。基于抗原試驗的敏感度差，限制了此類試驗在臨床上的應用，且不能減少臨床上對抗菌藥物的使用[12-13]。此外，常規病原學鑒定和培養是病原學診斷的基礎，但其耗時長且結果滯后，易延誤臨床決策，難以滿足臨床需要。目前，用于呼吸道病毒檢測的黃金診斷試驗是聚合酶鏈反應(PCR)，該方法具有高敏感性和高特異性，且不受患者感染時間和免疫功能的限制，但PCR試驗操作繁瑣，結果易受檢測環境影響，周轉時間至少為24 h,且需要專業的實驗室設施和專業知識[14]。

3.2 POCT-FilmArray呼吸道測試條 最近開發的新的快速分子檢測方法包括FilmArray呼吸道測試條[15]。FilmArray呼吸道檢測系統是經美國及歐洲食品藥品監督管理局(FDA)批準、有CE-IVD標記的多重巢式PCR以及自動化體外診斷系統,該檢測系統集樣品制備、擴增、檢測和分析功能于一體，作為體外診斷(IVD)設備，現已在國外大量投入臨床使用。FilmArray可以靶向20種病原體，包括17種病毒(及其亞型)和3種非典型病原體，包括甲型流感病毒(H1亞型、H1-2009亞型、H3亞型)、乙型流感病毒、腺病毒、冠狀病毒(HKU1、NL63、229E、OC43)、人類肺病毒、人類鼻病毒/腸病毒、副流感病毒(1型、2型、3型、4型)和呼吸道合胞病毒(RSV)，并能檢測出3種非典型病原體包括百日咳鮑特菌、肺炎衣原體和肺炎支原體[16-17]。該測定過程始于將300 mL未處理的生物/臨床樣品加入反應盒中，進行核酸提取、純化、反轉錄和多重聚合酶鏈反應、熔解曲線分析，最后是單個PCR階段。該儀器與軟件連接，實時分析熔解曲線變化與熒光曲線變化。該系統通過分析樣品擴增的DNA熔解曲線，從相應的擴增中自動識別病原體，最終報告每種病原體的陰性或陽性結果[18]。見圖1。

FilmArray呼吸道檢測系統綜合檢測陽性率高達90%以上，且其檢測靈敏度和特異度高達95%以上。與病原體培養鑒定和傳統PCR法相比，FilmArray 呼吸道檢測系統檢測速度快、檢測結果基本一致[18-19]。FilmArray 檢測手工操作耗時2 min，最后報告結果僅用1 h，在新生兒或感染百日咳鮑特菌的患者中，可以減少病原體的傳播概率，有助于快速將患者隔離[20]。國內一項研究[21]表明，FilmArray檢測肺炎支原體陽性的標本，經PCR 檢測也均為陽性；FilmArray檢測肺炎支原體陰性但血清學陽性的標本或均為陰性的標本，經PCR檢測均為陰性，說明FilmArray呼吸道檢測和PCR法一致性較好。

操作說明：將水合溶液和未知樣本加入1號試劑管中，FilmArray工具依次進行提取和純化核酸、反轉錄和多重聚合酶鏈反應。使用端點熔解曲線數據，FilmArray軟件自動為每個目標生成結果。其中1號孔中為控制物質(裂殖酵母)，2、3、4、5號孔中均為清洗緩沖液，6號孔為核酸清洗緩沖液，7號孔為逆轉錄/第一階段PCR預混液，8號孔為稀釋緩沖液，9、10號孔為第二階段PCR預混液，11號孔空、12號孔為第二階段PCR混合物的溢流容器[18]。

呼吸道病毒感染往往不是單一的病毒感染，可合并其他病原體感染。研究[22]發現，肺炎支原體感染在兒童中的患病率最高，其中以肺炎支原體合并呼吸道合胞病毒感染最為常見，因此對呼吸道感染患者的檢測不能僅僅局限于某個病毒的檢測，也要考慮混合感染的可能，FilmArray可檢測20種呼吸道病原體，能更高效的檢測患者感染的病原體種類。此外，在患有急性呼吸道疾病患者中，病毒是最常見的可檢測病原體，雖然可能存在普遍使用抗菌藥物的現象，但是檢測出細菌比病毒的概率要低。抗菌藥物過度使用的部分原因是急性呼吸道疾病病原體的不確定性，因此，可以通過FilmArray檢測早期識別病原體，從而減少抗菌藥物的過度使用。臨床研究[23]表明，使用FilmArray可縮短抗菌藥物使用的持續時間、患者住院時間和隔離時間。

FilmArray檢測相比其他檢測方法更有優勢。一項大型兒童醫院FilmArray檢測評估[24]結果顯示，FilmArray比直接免疫熒光法具有更高的敏感性。一項國外研究[25]收集315份急性呼吸道感染患者的呼吸道樣本，用免疫熒光法和FilmArray檢測法分別檢測8種呼吸道病毒，檢測結果顯示陽性率分別為75%和92%，兩種方法陽性一致率為70.5%，陰性一致率為99.6%。雖然診斷呼吸道病毒最常用的方法仍然是免疫熒光法，但將分子方法納入常規程序將大大提高感染的診斷率。FilmArray檢測還能夠檢測其他病毒，如冠狀病毒NL63、229E、OC43、HKU1和博卡病毒[26]，由此可知FilmArray檢測優于傳統的免疫熒光法。雖然多重PCR也可以同時檢測多種呼吸道病毒，但FilmArray檢測操作更簡單、檢測時間更短、檢測混合病毒感染的敏感性更高[27]。

綜上所述，FilmArray檢測為呼吸道感染的早期診斷提供了一種很好的檢測方法,可以幫助臨床醫生快速診斷病毒性呼吸道感染性疾病，有助于合理地應用抗病毒藥物,減少抗菌藥物濫用以及減輕患者的經濟負擔。

4 總結與展望

呼吸道感染性疾病嚴重危害著中老年人及兒童的健康。快速及準確地檢出病原體，對患者個性化治療及預后有著重要作用。病原體培養及常規PCR檢測結果準確度高，但耗時較長，POCT能夠簡化操作環節，縮短檢測時間，能夠快速、有效地診斷呼吸道感染性疾病，該技術是當前轉化研究的熱點，不斷更新迭代。其中FilmArray呼吸道檢測能提高呼吸道病原體的檢出率，有助于合理使用抗病毒藥物，減少不必要的抗菌藥物使用，為早期診斷及治療提供良好的依據，將是以后醫療機構內檢測呼吸道感染性疾病的重要手段之一。

雖然FilmArray可靠性、實用性和準確性均能滿足臨床診斷需求，但是標本采集方式不當也會影響檢測結果，應重視影響檢測結果的分析前因素，避免干擾；此外，由于每個實驗室檢測結果還不能統一標準化，檢測項目的不同方法之間尚存在差異，因此，POCT檢測結果應定期與臨床實驗室檢測結果進行比對，確保醫療機構內檢測結果的一致性；并且檢測人員應經過規范的培訓，按照廠商規定的要求進行操作，以保證檢測安全有效；最后還需要相關高質量的臨床隨機對照試驗進行確認，以及質量控制及臨床監管。