4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)細菌內毒素檢查法的研究

焉媛媛 林 鵬 趙志龍 王秀英

遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧 沈陽 110036

4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)為伊立替康脂質體注射液中的一種輔料。外觀是白色結晶粉末，含量：99.0%，分子式: C8H18N2O4S，分子量: 238.31，PH值范圍：6.8-8.2，性質比較穩定，貯存于2-8℃，陰涼干燥環境，用于生物緩沖液，對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的PH范圍，提升藥物療效，適用于醫藥產品的原料中。為控制產品質量，確保臨床用藥安全開展此項研究工作。

1 材料與儀器

1.1受試物：

1.114-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 規格原料藥,批號SLBP6989V，國藥一心制藥有限公司。2 . 鱟試劑：湛江安度斯生物有限公司，批號1705082，規格0.1ml，靈敏度0.125EU·ml-1，湛江博康海洋生物有限公司，批號1704110，規格0.1ml，靈敏度0.125EU·ml-1。3. 細菌內毒素檢查用水：湛江安度斯生物有限公司，批號1703210，規格2ml。4. 細菌內毒素工作標準品：批號150601-201782， 效價60EU·支-1，中國食品藥品檢定研究院。5. 儀器設備：電子天平，CP124S型 ，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司; 內毒素凝膠法測定儀，型號ET-96，天津市天大天發科技有限公司。

2 方法與結果

2.1鱟試劑靈敏度(λ)的復核試驗 按照《中國藥典》2015年版四部通則1143“細菌內毒素檢查法”進行檢查。使用靈敏度為0.125 EU·ml-1的鱟試劑。將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水稀釋至0.25、0.125、0.06、0.03 EU·ml-1。取復溶后的0.1ml鱟試劑溶液18支，其中16支分別加入0.1ml不同濃度的內毒素標準溶液，每個內毒素水平平行做4管；另外2管加入0.1ml細菌內毒素檢查用水作為陰性對照。加完樣品后，輕輕混勻，37±1℃保溫1小時，1小時后記錄試驗結果。結果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度標定結果

結果表明，兩個批次的鱟試劑標定結果均在0.5λ～2λ之間可用于細菌內毒素檢查。

2.2細菌內毒素限值的確定 根據制劑處方工藝，伊立替康脂質體注射液中鹽酸伊立替康與HEPES的投料質量比基本一致，因此HEPES內毒素限值可以參考鹽酸伊立替康的限值來確定。參照《中國藥典》2015年版四部通則9301“注射劑安全性檢查法應用指導原則”及1143“細菌內毒素檢查法”進行細菌內毒素限值的確定，并求得最大無干擾濃度。

本品最大用量為：L=K·M-1

M為人用每公斤體重每小時最大劑量，臨床用法用量：70mg·(m2)-1，靜脈滴注90分鐘以上，每2周一次。

K為靜脈給藥途徑，人用每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量,為5EU·(Kg·h)-1。

計算本品限值：L = K·M-1= 5EU·(kg·h)-1/70mg·(m2·1.5h)-1×0.027= 4EU·mg-1。

根據“化學藥品注射劑安全性檢查法應用指導原則”要求，本品理論限值為4EU·mg-1，本品申報限值為1EU·mg-1，約為計算限值的1/3，限值設置合理。

2.3供試品干擾試驗預試驗 按照《中國藥典》2015年版四部通則1143“細菌內毒素檢查法”檢查。使用靈敏度為0.125 EU·ml-1的鱟試劑，供試品濃度為0.2mg·ml-1溶液，陰性對照為細菌內毒素檢查用水，陽性對照為0.25EU·ml-1內毒素溶液，供試品陽性對照為以供試液稀釋的0.25EU·ml-1的內毒素溶液，加完樣品后，鱟試劑管用封口膜封好，輕輕混勻，37±1℃保溫1小時，1小時后記錄試驗結果。結果見表2。

表2 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)干擾預試驗結果

結果表明，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)0.2mg·ml-1溶液細菌內毒素檢查符合規定，初步確定0.2mg/ml溶液為最大無干擾濃度，0.2mg·ml-1溶液及以下濃度對樣品無干擾。

2.4供試品干擾試驗 按《中國藥典》2015年版四部通則1143“細菌內毒素檢查法”進行干擾試驗，使用濃度為0.2mg·ml-1的供試品溶液。使用湛江安度斯生物有限公司和湛江博康海洋生物有限公司生產的鱟試劑，靈敏度分別為0.125 EU·ml-1。將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水稀釋至0.25、0.125、0.06、0.03 EU·ml-1，供試品組用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)0.2mg·ml-1溶液代替細菌內毒素檢查用水將細菌內毒素工作標準品稀釋至0.25、0.125、0.06、0.03EU·ml-1，加完樣品后，鱟試劑管用封口膜封好，輕輕混勻，37±1℃保溫1小時，1小時后記錄試驗結果。結果見表3。

表3 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)干擾試驗結果

結果表明，用兩個廠家生產的鱟試劑進行干擾試驗，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)0.2mg·ml-1溶液對鱟試劑無干擾。

2.5細菌內毒素檢查 根據本品臨床用法用量，計算得出其細菌內毒素限值參考標準，經干擾試驗確證，其細菌內毒素限值標準可擬定為“每1mg中含內毒素的量應小于1EU”。

計算公式為：C=λ/L =0.125EU/ml/1EU/mg=0.1mg/ml按《中國藥典》2015年版四部通則1143“細菌內毒素檢查法”檢查。使用靈敏度為0.125EU·ml-1的鱟試劑，供試品濃度為0.2mg·ml-1溶液，陰性對照為細菌內毒素檢查用水，陽性對照為0.25EU·ml-1內毒素溶液，供試品陽性對照為以供試品2倍稀釋液稀釋的0.25EU·ml-1的內毒素溶液，加完樣品后，輕輕混勻，37±1℃保溫1小時，1小時后記錄試驗結果。結果見表4。

表4 細菌內毒素檢查試驗結果

結果表明，按照擬定標準檢驗，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)細菌內毒素檢查符合規定。

3 討 論

(一) 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)臨床用法用量：70mg·(m2)-1，靜脈滴注90分鐘以上，每2周一次。本品內毒素限值擬定為1EU·mg-1，對1批樣品細菌內毒素檢查符合規定。4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)是輔料，也是生物緩沖液，無細胞毒性，可以減小伊立替康脂質體注射液引起的毒性反應。

(二)細菌內毒素檢查法和傳統熱原檢查法的比較，細菌內毒素檢查法用鱟試劑其靈敏度高，準確性強，操作方便，受客觀影響因素較少；熱原檢查法，需要用家兔做試驗，成本高，誤差大，受客觀影響因素較多。現在越來越多的藥品施行細菌內毒素檢查法。

(三)伊立替康脂質體注射液，是抗腫瘤藥物，藥理作用為伊立替康是半合成喜樹堿的衍生物，它是一種治療轉移性結腸癌的有效藥物。喜樹堿可特異性地與拓撲異構酶Ⅰ結合，后者誘導可逆性單鏈斷裂，從而使DNA雙鏈結構解旋；伊立替康及其活性代謝物SN-38可與拓撲異構酶Ⅰ—DNA復合物結合，從而阻止斷裂單鏈的再連接。2015年美國FDA批準伊立替康脂質體注射液用于治療晚期胰腺癌。它可以使腫瘤增長開始時間延遲，伊立替康脂質體注射液與氟尿嘧啶/亞葉酸聯合用藥可以使患者平均生存期延長為6.1個月，而單純用伊立替康脂質體注射液治療患者生存期未見改善。另外，伊立替康脂質體注射液還是廣譜抗腫瘤藥物，對乳腺癌、胃腺癌都有抗腫瘤活性，還能抑制乙酰膽堿酯酶。伊立替康脂質體注射液發展前景廣闊，值得深入研究。