Wnt1、β-catenin、TCF4水平變化對結直腸癌患者預后的影響

崔瑛

（許昌市人民醫院質控辦，河南 許昌461000）

結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是世界上最常見的癌癥類型之一，每年約新發病例100萬例，在所有癌癥中發病率居第三位,嚴重影響人們的生活質量[1]。目前,結腸癌的治療方法涉及手術、化療、靶向治療等多種治療方法,取得了一定的效果[2]。然而，部分患者治療后往往復發，不利于患者改善預后。因此，預測術后預后和選擇合適的輔助治療是非常重要的，尤其對于II、III期CRC患者。雖然術前腫瘤標志物、腫瘤-結節-轉移（TNM）等多種臨床病理因素已被報道為影響預后的因素,但對復發高?；颊叩淖R別并不容易[3]。近年來，分子標記作為預測預后的標志物在CRC中得到了廣泛的關注。

無翼/集成（Wingless/Integrated，Wnt）信號通路是胚胎發育和成人組織中控制細胞行為規范的基本進化保守信號機制之一[4]。異常的Wnt信號通路激活與各種癌癥在內的多種疾病發生相關[5]。有三種不同的Wnt信號通路：β-連環蛋白(β-catenin)通路、鈣離子依賴（calcium-dependent）通路和平面細胞極性通路(planar cell polarity pathway)。三個Wnt信號通路進一步可分為規范和非規范信號通路，其中β-catenin通路，屬于規范的途徑,具有促進腫瘤細胞生長和增殖的作用[6]。為此,本研究對2011年5月至2014年5月期間106例TNM II期或III期CRC患者組織中Wnt/β-catenin信號通路及相關因子進行檢測,分析其與CRC預后的相關性，報告如下。

1 資料和方法

1.1 資料來源 收集2011年5月至2014年5月我院收治的TNM II期或III期CRC患者106例，男61例，女45例，年齡33～85歲，平均61.9±15.7歲，均經組織病理學確診，排除合并其它惡性腫瘤以及術前行放化療等治療的患者。

1.2 檢測方法 使用TRIzol（（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）試劑盒從組織中提取總RNA。采用TaKaRa Reverse Transcription Kit（TaKaRa，Dalian，China）將RNA逆轉錄為cDNA，反應條件為37°C 15 min，85°C 5s。然后將1:10稀釋的2μl cDNA加入25μl的反應體系（PCR mix 12.5μl、ROX 0.5μl、正向引物1μl、反向引物1μl和H2O 8μl），試劑盒采用TaKaRa公司的Power SYBR Green，反應條件為95 C變性30s，其次為95°C 5s、退火溫度下34秒的35循環，最后溶解曲線分析。儀器采用ABI Prism 7700 Sequence Detection System實時熒光定量PCR儀。采用βactin和GAPDH作為內參基因。Wnt1、β-catenin、TCF4、β-actin和GAPDH擴增引物序列見表1。

表1 基因PCR擴增引物序列及退火溫度

1.3 統計學方法 經Kolmogorov-Smirnov分析，各組水平數據呈正態分布，用平均值±標準差（±s）表示,組間比較采用方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,采用統計學分析軟件SPSS19.0進行分析。

2 結果

2.1 Wnt1、β-catenin、TCF4在CRC患者組織中的表達 CRC患者癌組織中Wnt1、β-catenin、TCF4 mRNAs表達水平明顯高于癌旁正常組織，差異具有統計學意義（P<0.001）。見表2。

表2 Wnt1、β-catenin、TCF4在CRC患者組織中的表達（±s）

表2 Wnt1、β-catenin、TCF4在CRC患者組織中的表達（±s）

組別 例數癌旁正常組織癌組織t值P值106 106 Wnt1 β-catenin 1.07±0.56 3.25±1.61 14.343<0.001 0.97±0.63 5.33±2.96 19.967<0.001 TCF4 1.03±0.57 7.18±3.53 23.517<0.001

2.2 Wnt1、β-catenin、TCF4的表達與CRC患者臨床病理參數的關系106例CRC組織中Wnt1的表達與腫瘤大小、浸潤程度和局部淋巴結轉移密切相關（P<0.05）；β-catenin的表達與分化程度、浸潤程度和局部淋巴結轉移密切相關（P<0.05）；TCF4的表達與浸潤程度和局部淋巴結轉移密切相關（P<0.05）。三項指標均與與患者年齡、性別和腫瘤部位無關（P均>0.05）。見表3。

2.3 Wnt1、β-catenin、TCF4表達與CRC患者預后的關系 106例CRC患者的隨訪時間為3~60個月，中位隨訪時間為28.9±11.2個月。隨訪期間59例發生死亡，死亡率為55.7%。COX單因素分析,浸潤程度、局部淋巴結轉移、Wnt1、β-catenin和TCF4是CRC患者預后的影響因素；進一步納入多因素模型進行分析,顯示局部淋巴結轉移、Wnt1、βcatenin和TCF4是CRC患者預后的獨立因素。見表4。

3 討論

TNM分期臨床上決定CRC患者預后的重要標準,其中TNM II期和III期腫瘤約占CRC患者的70%[7]。雖然研究顯示多學科聯合治療成功地誘導了約60%的II期和II期臨床緩解,但目前關于II期和III期患者的治療方案選擇仍存在較大爭議。NCCN指南規定，治療原發性非轉移性結腸癌的手術和輔助全身治療,后者需要根據病理分期和臨床特點。通常認為,輔助化療通?？梢蕴岣逫II期CRC患者的無病生存率，然而，T1-2N1M0腫瘤（IIIA期）患者的生存率明顯高于IIB期腫瘤患者，并且相當一部分III期患者僅僅遭受化療的副作用，提示輔助化療需要優化[8]。同時研究顯示[9]，約30%的組織學上沒有淋巴結受累的CRC患者術后5年內死于遠處轉移或局部復發，提示單純的TNM分期不能充分預測CRC的臨床進程。因此，尋找其它有效指標準確地識別II期高?；颊吆虸II期低復發風險患者，顯得迫切需要。

表3 Wnt1、β-catenin、TCF4的表達與CRC患者臨床病理參數的關系

表4 COX分析影響CRC患者整體生存的預后因素

Wnt信號通路在維持正常細胞穩態和胚胎發育中發揮重要作用,目前已知其與包括CRC在內的多種腫瘤進展相關[10]。Wnt蛋白是分泌糖蛋白，是Wnt信號通路的配體。Wnt有19個亞型，Fz有10個亞型，它們具有相同的遺傳結構同源性。單個Wnt配體和Fz受體可以激活不同疾病的典型或非典型通路，因此Wnt信號通路非常復雜。在目前的研究中，我們關注Wnt1/β-catenin通路。Wnt-1最初被認為是小鼠乳癌病毒（mouse mammary tumor virus，MMTV）插入激活的靶點,從而導致乳腺增生。在哺乳動物細胞中，Wnt-1被認為是一種分泌的生長因子，與細胞表面結合同源Fz受體相互作用時，產生Wnt信號級聯反應,從而影響細胞的各種功能,包括細胞的運動性、極性和增殖[11]。在細胞內部，信號通過散體蛋白（dsh）和zesti-white 3-糖原合成酶激酶3~（zw3/GSK3）基因的蛋白產物進一步轉導[12]。Wnt1可以調節腫瘤細胞形態上的變化，這些變化有利于腫瘤細胞的轉移[13]。本研究中，106例CRC患者癌組織中Wnt1的表達要明顯高于癌旁正常組織，并且與腫瘤大小、浸潤程度和局部淋巴結轉移密切相關（P<0.05），提示其在CRC發生發展中起到重要作用。

β-catenin是一種多功能蛋白,主要結構包括130個氨基酸氨基末端結構域、包含42個氨基酸的12個不完全重復（又稱，Arm重復）和100個氨基酸的羧基末端結構域。β-catenin的氨基端對調節該蛋白的穩定性具有重要作用,而羧基端融合到GAL4 DNA結合域時,可起到激活轉錄的作用[14]。除了在粘附連接處的結構功能外，β-catenin在Wnt配體刺激的細胞的細胞質中積累，并介導細胞核中的Wnt信號轉導，而β-catenin的累積是Wnt信號轉導的關鍵事件。核β-catenin與淋巴增強子結合因子/T細胞因子（LEF/TCF）家族的DNA結合蛋白結合,從而將TCF從轉錄抑制因子轉化為激活因子[15]。TCF/β-catenin復合物進一步上調Wnt的靶基因如c-myc，cyclin D1、CD44、Axin2和SP5的表達[16]。在沒有Wnt刺激的情況下，細胞質中的β-catenin可與酪蛋白激酶1α（CK1α）和糖原合成酶激酶3（GSK-3）等形成細胞質蛋白復合物。最終，氨基端磷酸化的β-catenin被泛素化并隨后被蛋白酶體破壞[17]。β-catenin可通過同時與E鈣粘蛋白和α鈣粘蛋白結合,將粘附分子連接到細胞骨架聚合物肌動蛋白上,細胞粘合連接并且核βcatenin表達升高被認為是異常β-catenin信號通路激活和促進腫瘤進展的跡象[18]。Xu等[19]研究發現，細胞核中β-catenin的升高與腫瘤患者的與不良預后相關。本研究結果顯示，CRC癌組織中βcatenin的表達與分化程度、浸潤程度和局部淋巴結轉移密切相關（P<0.05），與相關報道一致。

TCF4對于小腸和結腸上皮細胞的胚胎發育和成體組織穩態至關重要。當在高遷移率族DNA結合結構域序列的緊鄰上游插入產生潮霉素B磷酸轉移酶的表達盒時，TCF4可被全身敲除，從而導致小鼠由于小腸失去增殖能力而在圍產期死亡[20]。Wang等[21]研究顯示，腸組織中TCF4的靶向缺失伴隨著小腸和結腸中增殖細胞的喪失。同時，譜系示蹤實驗表明,成年Tcf4缺陷的小腸和結腸干細胞不會促進上皮自我更新[22]。Hua等[23]研究顯示，TCF4是CRC的發生、發展的重要因素。本研究結果也顯示TCF4在CRC癌組織中明顯升高,并且其表達與浸潤程度和局部淋巴結轉移密切相關(P<0.05)。COX多因素模型進行分析顯示，TCF4和Wnt1、β-catenin均是CRC患者預后的獨立因素。

綜上所述,Wnt1、β-catenin和TCF4可以有效預測TNM II期和III期CRC患者的預后,便于臨床制定更有效的CRC綜合治療方案。