循環(huán)腫瘤細胞技術(shù)臨床應用的前沿進展

胡志遠，李雪杰

（1.國家納米科學中心，北京北京100190；2.福建醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，福建 福州3501221）

癌癥是嚴重威脅全球生命健康的主要疾病。2021年初，由美國癌癥學會（American Cancer Society,ACS）學術(shù)期刊CA：A Cancer Journal for Clinicians（IF=292）發(fā)布了最新版Global cancer statistics 2020[1]。數(shù)據(jù)顯示：在2020年，全球估計有1,930萬例新發(fā)癌癥病例和1,000萬例癌癥患者死亡。良性腫瘤與惡性腫瘤最重要的區(qū)別之一在于后者具有較強的轉(zhuǎn)移侵襲能力，可向遠端器官轉(zhuǎn)移，而這往往是導致患者死亡的最終原因[2]。

循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cell，CTC)的概念由澳大利亞病理學家Thomas Ashworth在18 69年第一次提出[3]。是指從惡性腫瘤組織中脫落,進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。CTC通常是指上皮來源實體瘤釋放到外周血的腫瘤細胞，遠端轉(zhuǎn)移是通過外周血進行的，CTC是腫瘤轉(zhuǎn)移的種子，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵作用。

1 循環(huán)腫瘤細胞概述

CTC具有顯著的異質(zhì)性。惡性腫瘤具有異質(zhì)性的特點,同一患者的不同部位腫瘤之間或者同一腫瘤部位的不同細胞之間或同一患者同一腫瘤不同階段的基因和表型各不相同（時空異質(zhì)性）[4]。因此CTC也具有極強的異質(zhì)性,根據(jù)其物理學和生物學的不同特征可分為許多不同亞型。不僅其細胞表面抗原表達譜會有差異,且細胞大小、核質(zhì)比、細胞表面特性也不相同。

多數(shù)CTC具有上皮細胞特征。上皮組織來源的惡性腫瘤約占所有惡性腫瘤病例的80%到90%，因此大多數(shù)的CTC具有上皮細胞的特性，這是CTC富集檢測的病理學基礎(chǔ)。

近年來，腫瘤免疫治療發(fā)展迅速，其中最有效的方法之一是對免疫檢查點的抑制,以程序性死亡受體/配體(PD-1/PD-L1)為主要的治療靶點，阻斷腫瘤的免疫逃逸機制[5]。但并非所有腫瘤患者都能從該靶點治療中獲益,故尋找明確的生物標志物以在早期預測和評估療效是非常重要的。有不少研究指出，液體活檢CTC可在早期及治療進程中對PD-L1的表達狀態(tài)進行動態(tài)監(jiān)測[6]，所以CTC聯(lián)合PD-L1的檢測可能成為液體活檢臨床應用的新趨勢。

2 CTC的檢測技術(shù)

由于外周血中CTC含量極其稀少，在105～107個血細胞中僅有一個CTC[7]，因此首先需要高效率捕獲富集患者血樣中的CTC之后再將富集的細胞進行各種分析鑒定,以細胞計數(shù)或分子分型等形式為臨床提供診斷信息。

2.1 CTC分離富集技術(shù) 富集技術(shù)主要分為基于免疫親和性或基于生物物理特性(細胞大小、密度、變形性、電荷特征等)進行捕獲。目前應用最為廣泛的是以免疫親和為基礎(chǔ)的富集技術(shù),采用與適當基質(zhì)(如磁珠)結(jié)合的抗體、核酸適配體或多肽與CTC表面靶抗原結(jié)合,通過磁力或其它作用力進行陽性或陰性選擇實現(xiàn)CTC的富集。陽性選擇是直接通過CTC表面某些特殊的生物標志物,如上皮細胞黏附分子（EpCAM)富集相應的抗體捕獲CTC；陰性選擇則利用白細胞表面特異性抗原(主要為CD45)去除血液中白細胞進而富集CTC。

CellSearch檢測系統(tǒng)由美國強生子公司（Veridex公司）研發(fā)，是全球唯一通過FDA（2004年）和NMPA（2020）批準用于CTC臨床診斷的系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用抗EpCAM抗體包裹的鐵磁流體納米顆粒陽性富集表達EpCAM的CTC細胞。在2020年NMPA批準的臨床用途包括：用于全血中的上皮源性的CTC的計數(shù)檢測,主要用于對惡性腫瘤患者進行動態(tài)監(jiān)測以輔助判斷疾病進程或治療效果。可見上皮源性循環(huán)腫瘤細胞的臨床證據(jù)較為充分,已經(jīng)獲得醫(yī)學界和監(jiān)管部門的廣泛認可。但是該系統(tǒng)的靈敏度不足一直是其廣泛臨床應用的障礙。

為解決該系統(tǒng)靈敏度不足的缺陷,中科院國家納米科學中心自主研發(fā)了TumorFisher技術(shù)[8],構(gòu)建了高特異識別EpCAM的多肽替代抗體來富集CTC。由于多價態(tài)效應和納米結(jié)構(gòu)優(yōu)化使多肽納米磁珠與腫瘤細胞結(jié)合力優(yōu)于抗體磁珠,靶向性更好，結(jié)合位點更多，因此檢測靈敏度大大優(yōu)于抗體磁珠，從而提高了對EpCAM低表達的CTC細胞識別捕獲。該技術(shù)在乳腺癌預后和動態(tài)監(jiān)測、肺癌的早期診斷以及消化道腫瘤PD-1藥物療效預測[9]等方面展現(xiàn)了巨大的臨床應用價值,為業(yè)界所關(guān)注與重視。

備受關(guān)注的陽性富集技術(shù)還有CTC-chip，是一種基于免疫親和性及微流控芯片的CTC富集技術(shù)，在970mm2的表面，排列了78,000個被EpCAM抗體包被的硅柱,將全血中的CTC吸附到芯片上以達到高效率CTC的捕獲[10]，雖然目前已發(fā)展到第三代技術(shù),但該系統(tǒng)仍缺乏大樣本臨床試驗數(shù)據(jù)支撐,另外芯片的高成本也使其臨床應用受到了限制。

2.2 CTC的分析鑒定 經(jīng)過有效富集之后需對CTC進行分析鑒定，可分為免疫熒光鑒定技術(shù)、分子檢測技術(shù)和基于細胞功能異常的檢測技術(shù)等。

2.2.1 免疫熒光鑒定技術(shù) 目前已經(jīng)獲得大量的臨床數(shù)據(jù)支持。NMPA最新批準的CellSearch檢測系統(tǒng)，包括磁流體捕獲試劑和熒光免疫試劑，檢測流程為：將7.5ml血樣經(jīng)免疫磁珠分離富集,獲得Ep CAM陽性的細胞,再經(jīng)免疫細胞化學技術(shù)鑒定CTC并進行計數(shù)。在分析鑒定中，需將富集的細胞進行標記,如上皮標志物細胞角蛋白-藻紅蛋白、白細胞標志物CD45-異藻藍蛋白和DAPI標記有核細胞。之后通過熒光顯微鏡對細胞進行掃描，當細胞的形態(tài)學特征表現(xiàn)為EpCAM+、CK+、CD45-和DAPI+，即判定為CTC。國內(nèi)外的大量臨床研究都證實了該系統(tǒng)的臨床價值。Cristofanilli M等[11]使用CellSearch檢測系統(tǒng)對來自18個隊列，2,436例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的7.5ml血樣進行分析，以CTC計數(shù)≥5個為閾值。經(jīng)過數(shù)據(jù)匯總分析發(fā)現(xiàn)，CTC計數(shù)≤5個的患者具有比CTC的計數(shù)≥5個的患者更長的中位總生存期 (36.3 months vs.16.0 months,P<0.0001)。Trapp E等[12]對1,087例乳腺癌患者使用CellSearch系統(tǒng)在化療之前和2年之后（198名患者，18.2%，CTC陽性）評估了CTC的存在，得出結(jié)論：化療2年后CTC的存在與總生存期（Overall survival,OS）和無病生存期（Disease-free survival,DFS）降低有關(guān)。

基于臨床試驗數(shù)據(jù)，2018年AJCC第八版將CTC列入乳腺癌預后評估工具[13]；2019年在中國臨床腫瘤學會(CSCO)中,將CTC寫入了《2019CSCO乳腺癌診療指南》。最近研究發(fā)現(xiàn)，基于免疫熒光檢測來分析CTC,可以發(fā)現(xiàn)患者腫瘤細胞是否存在某些治療分子靶點，從而優(yōu)化患者的靶向治療。目前臨床證據(jù)較多的是消化道癌PD-L1和乳腺癌HER2等藥物靶點的療效預測。

2.2.2 分子檢測技術(shù)CTC具有與原發(fā)腫瘤相似的基因組[14]，因此分子檢測技術(shù)可進一步在CTC計數(shù)的基礎(chǔ)上分析其分子特征進行分子分型，評估基因的變化，探索疾病的分子演變機制。分子檢測技術(shù)要求從活的CTC中分離核酸,之后檢測其中基因的突變或DNA甲基化[15]。目前檢測技術(shù)包括熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈式反應(PCR)和高通量測序法(Next generation sequencing,NGS)等。

2.2.3 基于細胞功能異常的檢測技術(shù) 是利用腫瘤細胞所具有的生物學行為特性鑒定血液中的CTC。這些特征包括維持增值信號，逃避生長抑制，抑制細胞死亡，無限自我復制，誘導血管生成，激活侵襲轉(zhuǎn)移，逃避免疫清除，促進腫瘤炎癥，能量代謝異常和基因組不穩(wěn)定這十大特征[16]。由于各種癌癥普遍具有這些功能性特征,因此有可能以較高特異性區(qū)分腫瘤細胞與正常細胞。基于腫瘤細胞能量代謝異常鑒定CTC的原理是在氧充足的情況下,腫瘤細胞具有與正常細胞不同的能量代謝途徑,即腫瘤細胞不以三羧酸循環(huán)而主要以糖酵解的途徑進行糖代謝，表現(xiàn)為葡萄糖攝取率高（Warburg effect）[17]。有研究通過熒光標記葡萄糖類似物（2-NBDG）表征細胞的葡萄糖攝取能力，并加入白細胞標志物CD45高通量鑒定肺癌患者胸腔積液和外周血液樣本中的腫瘤細胞。即CD45-，2-NBDG高攝取的細胞鑒定為高代謝活性的腫瘤細胞，并通過單細胞測序來驗證鑒定結(jié)果。結(jié)果表明，對于肺癌患者的胸腔積液和外周血液樣本,鑒定的腫瘤細胞中超過60%的細胞檢測到了與原位腫瘤一致的基因突變，證明基于能量代謝異常檢測體液樣本中的CTC具有較高的特異性[18]。

以上三種技術(shù)路徑,第一種免疫熒光鑒定技術(shù)臨床證據(jù)最為充足、臨床應用更為廣泛,以CellSe arch技術(shù)與TumorFisher技術(shù)為代表,得到醫(yī)學界與學術(shù)界廣泛認可。

2.3 CTC的單細胞測序 單細胞測序技術(shù)能從單個腫瘤細胞水平分析腫瘤的異質(zhì)性,包括基因單個堿基突變（Single-nucleotide variants，SNV）、短序列插入/缺失（Insertions and deletions,Indel）和基因拷貝數(shù)變異（Copy number variants，CNV）等以及基因表達差異和蛋白質(zhì)修飾差異等[19]。利用單細胞測序技術(shù)分析CTC,可為臨床提供微創(chuàng)的方法來表征腫瘤的異質(zhì)性以及監(jiān)測腫瘤的轉(zhuǎn)移機制[20]。Paoletti C團隊[21]在12例乳腺癌患者中獲得可評估CTC基因組的76個樣本（單細胞或合并細胞），分析此前研究確立的來自乳腺癌患者CTC測序的130個基因與腫瘤組織單細胞檢測結(jié)果的比較,發(fā)現(xiàn)二者至少一種或多種體細胞突變和基因拷貝數(shù)變異達到了85%的一致性。該結(jié)論支持CTC測序可以提供有關(guān)腫瘤異質(zhì)性的重要信息。Chemi F[22]等利用單細胞測序技術(shù)分析肺靜脈CTC基因組,發(fā)現(xiàn)相比于在原發(fā)腫瘤的突變特征的重疊,肺靜脈CTC基因在10個月后的轉(zhuǎn)移灶中有更高的突變重疊（91%vs.79%）,由此可分析腫瘤的轉(zhuǎn)移機制進行早期干預。對于新興的強有力武器—CTC單細胞測序，目前處于起步階段，仍需大量的臨床試驗來證明其臨床應用價值，真正實現(xiàn)由科學研究向臨床應用的轉(zhuǎn)化。

3 CTC臨床應用存在的挑戰(zhàn)

CTC在腫瘤學領(lǐng)域的臨床應用價值已有大量的臨床試驗證實[23]。主要包括腫瘤復發(fā)的早期診斷、判斷預后以及療效監(jiān)測，實現(xiàn)對患者的精準醫(yī)療。但是由于CTC的特殊性質(zhì)，將其研究成果轉(zhuǎn)化應用于臨床還存在著許多問題和挑戰(zhàn)。

3.1 CTC是血液中非常稀有的細胞，研發(fā)適宜CTC培養(yǎng)的技術(shù)平臺進行后續(xù)功能的分析具有高度的挑戰(zhàn)性 若能夠富集活的CTC就可以進行下游分子分析（DNA,RNA,蛋白質(zhì)組學表征），從分子水平對細胞的藥物反應進行分析,將更清楚地了解腫瘤的發(fā)生機制以及治療靶點[24,25]。

3.2 腫瘤細胞具有高度異質(zhì)性且轉(zhuǎn)移過程中會發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)[26],且循環(huán)腫瘤細胞團也為CTC計數(shù)增添了難度 隨著腫瘤的生長,有一部分腫瘤細胞會調(diào)控特定分子,發(fā)生表達譜的改變而發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。發(fā)生EMT的CTC增加了在外周血中的存活能力。但是CTC要轉(zhuǎn)移出血管，移植到其它組織器官，又需要轉(zhuǎn)變回上皮表型,稱為間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(Mesenchymal-epithelial transition，MET)。因此CTC可被分成上皮型、間質(zhì)型和上皮間質(zhì)混和型，并且這幾種類型是在不斷動態(tài)轉(zhuǎn)化的。有研究表明，混合型CTC的生存和轉(zhuǎn)移能力最強。上皮型和混合型的CTC可通過細胞表面EpCAM蛋白而被識別捕獲,而間質(zhì)型CTC可通過細胞表面細胞表面波形蛋白(CSV)或N-鈣粘蛋白(N-Cadherin)蛋白分子捕獲。鑒定各種亞型的CTC需要尋找多種具有特異性的腫瘤標志物進行聯(lián)合檢測,如上皮細胞型標志物（CK、EpCAM和葉酸等）、間質(zhì)型標志物（波型蛋白、纖維連接蛋白1等）和腫瘤相關(guān)抗原（甲胎蛋白、癌胚抗原和PD-L1等）。通過多種標志物進行聯(lián)合檢測將更好地研究腫瘤的異質(zhì)性,指導臨床醫(yī)生對患者進行個體化治療。部分CTC聚集成團，形成循環(huán)腫瘤細胞團（Circulating tumor microemboli,CTM）,其轉(zhuǎn)移潛能比單獨CTC高23-50倍[27]。由于CTC具有高度異質(zhì)性,這是全世界醫(yī)學界和產(chǎn)業(yè)界面臨的共同難題。因此尋找腫瘤細胞的特異靶標，優(yōu)化CTC鑒定方法，包括CTM的聯(lián)合檢測，都是使CTC應用于臨床亟需突破的瓶頸,目前的解決方案是由廠家提供自身產(chǎn)品標準,根據(jù)其CTC亞型的特點找到其診斷應用。

3.3 目前市場上CTC的檢測平臺眾多，各個平臺對標本檢測前的處理流程以及檢測流程有很大差異[28]，除了CellSearch系統(tǒng)在大量的臨床試驗中進行了驗證，在使用CTC計數(shù)應用于臨床時，不同的平臺其cut-off值尚無定論 因此需要通過大樣本的臨床試驗以規(guī)范操作流程,建立統(tǒng)一標準使得檢測結(jié)果具有可比性和穩(wěn)定性。近年來人工智能技術(shù)在臨床病理研究中進展迅猛,未來在CTC中的臨床應用可以期待。

4 CTC用于精準醫(yī)學——在PD-1/PD-L1免疫治療中的應用

腫瘤治療經(jīng)歷了從傳統(tǒng)治療到靶向治療以及近幾年發(fā)展迅速的免疫治療,使得腫瘤治療取得了顯著的進展。其中免疫檢查點抑制療法備受關(guān)注，代表性藥物為程序性死亡受體1（Programmed cell death 1,PD-1）及其配體（Programmed cell deathligand 1,PD-L1）抑制劑[29]。PD-1/PD-L1結(jié)合產(chǎn)生共抑制信號阻斷T細胞的活化,從而發(fā)生了免疫逃逸[30]，而免疫檢查點抑制劑PD-1/PD-L1藥物即作用于該靶點以活化T細胞來進而殺傷腫瘤細胞。

自從2014年FDA批準PD-1抗體Pembrolizumab和Nivolumab用于治療晚期黑色素瘤，國內(nèi)外已有大量PD-1/PD-L1抑制劑藥物在不同癌種獲批應用。盡管免疫療法顯示出巨大的臨床應用價值，但僅有部分患者可以從該療法中獲益，因此治療前從患者中早期精準篩選出最佳響應個體顯得尤為重要。目前臨床研究中的腫瘤免疫治療生物標記物包括：⑴通過免疫組織化學（Immunohistochemistry,IHC）檢測PD-L1在腫瘤細胞中的表達水平[31]；⑵腫瘤突變負荷（Tumor mutation burden,TMB）檢測，TMB越高，腫瘤的免疫原性越高，從腫瘤免疫治療中獲益的可能性就越大[32]。⑶基因錯配修復和微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MMR/MSI），MMR/MSI是FDA批準的抗PD-1/PD-L1治療的伴隨診斷標志物[33]。但這些檢測采用的組織活檢具有侵入性和無法反復獲取,且腫瘤組織具有異質(zhì)性使這些檢測結(jié)果不夠精準[34]。Carbognin L[35]報道,在511例腫瘤組織PD-L1陽性的非小細胞肺癌（NSCLC）患者中,采用Nivoluma治療的患者其客觀緩解率（ORR）僅在16%到50%之間。證實了從腫瘤組織檢測PD-L1的局限性。液體活檢CTC技術(shù)的出現(xiàn)或許可以彌補傳統(tǒng)檢測方法的不足[36]。

4.1 CTC檢測為解決以上難點提供了新的思路無需進行組織活檢，即可實現(xiàn)實時動態(tài)無創(chuàng)取樣，從而預測免疫治療療效，且在治療過程中實時監(jiān)測以提供腫瘤耐藥的信息。2015年Mazel M[37]等首次在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的血液中檢測到表達PDL1的CTC。

4.1.1 用藥前PD-L1高表達CTC可預測PD-1藥物療效 徐建明團隊[8]對35例晚期胃腸道腫瘤患者進行了抗PD-1治療的1期臨床試驗(IBI308)。該研究團隊利用TumorFisher技術(shù),建立了首個PD-L1表達半定量熒光分析體系,將患者按照基線CTC-PD-L1表達水平進行分層（PD-L1陰性、PD-L1低表達、PD-L1中等表達和PD-L1高表達）。PD-L1高表達比例≥20%的患者對藥物的客觀響應率高達64%,而比例＜20%的患者的客觀響應率只有14%；PD-L1高表達比例≥20%的患者比PD-L1高表達比例＜20%的患者具有更長的中位無進展生存期 （4.27 months vs 2.07 months,P=0.002）。

4.1.2 CTC-PD-L1檢測在雙藥聯(lián)用也有更好的療效預測價值 徐建明利用TumorFisher CTC檢測體系，探究PD-1免疫檢查點抑制劑SHR-1210聯(lián)合阿帕替尼在治療晚期肝癌、胃癌和胃食管交界處癌的療效預測[38]。41例患者在治療前采取外周血，檢測外周血中CTC-PD-L1的表達水平，39例,靈敏度95.1%,血液中檢測到CTC；35名可評估患者中有29名（82.9%）患者有PD-L1高表達的CTC。CTC-PD-L1高表達比例≥20%為閾值,PD-L1高表達CTC的患者中ORR為47.8%（11/23例）,而低表達的患者中客觀緩解率ORR為0%（0/12例,P=0.002）。此外，CTC-PD-L1高表達的患者具有更長的無進展生存期（中位數(shù)6.1 months vs.2.9months,HR:0.28,95%CI:0.12-0.67；P=0.0002）且OS顯著延長 （median NR vs.8.9months,P=0.0601）。提示CTC-PD-L1表達水平可作為抗PD-1/PD-L1免疫治療的預測指標和對患者進行分層的生物標志物。

5 小結(jié)和展望

CTC在腫瘤早期篩查、動態(tài)監(jiān)測以及免疫治療選擇等方面的研究取得了顯著成果，CTC檢測是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乔秩胄阅[瘤診療手段之一。雖然目前由研究成果的臨床轉(zhuǎn)化還面臨許多挑戰(zhàn),但隨著富集技術(shù)的不斷提高以及鑒定不同類型CTC特異性生物標志物的發(fā)現(xiàn)，CTC檢測的敏感性和特異性將顯著提升。與常用的腫瘤診斷方法如影像學證據(jù)和組織活檢相比，CTC檢測具有早期、高效、取材方便和可重復監(jiān)測等優(yōu)勢。與常規(guī)腫瘤標志物檢測相比，CTC檢測通常能更早反映疾病的變化。CTC分子分析能獲得的大量信息，彌補目前醫(yī)療手段的不足,特別值得指出的是CTC單細胞測序技術(shù)未來將有廣泛的應用前景和發(fā)展空間，對于了解實體瘤的進化過程及患者個體化治療具有巨大的意義。