沙門氏菌H鞭毛抗原純培養(yǎng)和位相變異方法改進及效果的分析

趙衛(wèi)紅，黃曾，鄒錦群，詹卓蓬，丁欣悅，龔怡靜

（1.豐城市疾病預防控制中心檢驗科，江西 豐城331100；2.武漢體育學院研究生院健康科學院，湖北 武漢430079）

沙門氏菌可以通過水源、食物等途徑引起食物中毒,敗血癥等病，85%的食物中毒是由沙門氏菌引起[1]。GB29921-2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》中沙門氏菌是主要限量菌之一，且限量為0cfu/25g或ml,為所有微生物限量標準中的最嚴格級[2]。

沙門氏菌對人類的威脅已超過數(shù)百年,全球每年有超過1億人感染。在亞太地區(qū),每10萬人中有32人感染,其中東亞地區(qū)最嚴重,每1O萬人中有3600人感染,全球每年因沙門氏菌而死亡的人數(shù)高達15.5 萬人,死亡率居亞洲國家和東南亞國家最高[3]。我國每年至少200萬人感染沙門氏菌，造成成千上萬人住院，數(shù)百人因此而死亡[4]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報告,世界各國沙門氏菌食物污染日益嚴重，造成巨大經(jīng)濟損失[5]。

近年來沙門氏菌檢測與分型手段有了長足進步,但大部分是基于核酸的分子生物學等檢測技術(shù),這些方法門檻要求高，成本貴，限制了其在基層應用[6]。在基層常用的傳統(tǒng)檢測方法中，血清學分型是沙門氏菌命名及菌株溯源的關(guān)鍵步驟，但實際檢測過程中沙門氏菌的血清分型工作量大、步驟繁雜，靈敏度低，尤其是沙門氏菌H鞭毛抗原難以檢測，常需誘導多次[7]，導致整個檢測過程耗時長、易出錯、成本高[8]，人員勞動強度大。有報道顯示，沙門氏菌H鞭毛抗原較易發(fā)生H-O變異[7]，而H鞭毛抗原如何恢復表達的有關(guān)報道很少[1]。所以,實現(xiàn)H鞭毛抗原的快速、低成本、高成功率的誘導表達對沙門氏菌的快速檢測和分型具有十分重要的意義。本研究探討沙門氏菌H鞭毛抗原純培養(yǎng)和H鞭毛抗原誘導方法的改進,使沙門氏菌的血清學分型工作省時、簡單、高效、成本低，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 ⑴2020年3月-5月份對禽類、水產(chǎn)品等120份樣品做沙門氏菌檢測獲得14株沙門氏菌菌株：有典型生化反應、A-F O多價陽性、O單因子抗原鑒定陽性、需要鑒定H鞭毛抗原的沙門氏菌菌株。⑵其他16份已經(jīng)血清學分型鑒定了的沙門氏菌菌株來自江西省疾病預防控制中心和宜春市疾病預防控制中心。⑶試驗標準菌株是由省疾病預防控制中心提供。

1.2 試驗試劑PCA、布氏肉湯、BPW（緩沖蛋白胨水）、SC（亞硒酸鹽胱氨酸）、TTB(四硫磺酸鈉煌綠）、BS（亞硫酸鉍）、沙門氏菌顯色瓊脂平板、沙門氏菌生化鑒定試劑、半固體、雙糖鐵(青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司)、沙門氏菌診斷血清（寧波天潤生物藥業(yè)有限公司）等，試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 儀器與設備 YC-180澳柯瑪冰箱（澳柯瑪股份有限公司）、JM-A電子天平（諸暨市超澤衡器設備有限公司）、BSC-1300ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、CJV1500T潔凈工作臺（山東新華醫(yī)療器械廠）、LMQ.C立式滅菌器（山東新華醫(yī)療器械廠）、5V電動移液槍（DLAB Scientific Inc）

1.4 方法 試驗整個過程用沙門氏菌標準菌株作對照

1.4.1 檢測前準備 120份禽類及其內(nèi)臟、水產(chǎn)品，獸類等樣品按照GB 4789.4-2016檢測鑒定沙門氏菌。獲得14株沙門氏菌：有典型生化反應、A-F O多價陽性，O單因子抗原鑒定陽性，需要鑒定H鞭毛抗原的沙門氏菌菌株。

配制所需試劑，高壓滅菌所需器材、試劑，復蘇菌株，劃線接種至沙門氏菌顯色瓊脂平板，36℃24h培養(yǎng)后，挑單個典型菌落試驗。對30株沙門氏菌菌株鑒定生化反應情況、A-F O多價陽性，O單因子抗原鑒定陽性。

1.4.2 沙門氏菌菌株純培養(yǎng)后H鞭毛抗原血清學鑒定 30株沙門氏株按照：同一株沙門氏菌同時用兩種試驗法做純培養(yǎng)后H鞭毛抗原血清學鑒定（一）依據(jù)GB4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》：從沙門氏菌顯色瓊脂平板挑紫紅色，半透明，中等大小的菌落直接劃線接種到普通營養(yǎng)瓊脂平板上，36℃24h純培養(yǎng)后，用沙門氏菌診斷血清檢測H鞭毛抗原（二）改進的沙門氏菌純培養(yǎng)試驗法：從沙門氏菌顯色瓊脂平板挑紫紅色，半透明，中等大小的菌落直接涂布接種到加了1.5ml布氏肉湯的PCA瓊脂平板上，36℃24h純培養(yǎng)后，用沙門氏菌診斷血清檢測H鞭毛抗原因子，二者進行24h時間培養(yǎng)后兩相H鞭毛抗原都檢出來的陽性率比較。

1.4.3 沙門氏菌H鞭毛抗原位相變異試驗法 同一株沙門氏菌（按照GB4789.4-2016沙門氏菌H鞭毛純培養(yǎng)法檢驗只檢出一相H鞭毛抗原的22株沙門氏菌）同時用二種試驗法做H鞭毛抗原位相變異培養(yǎng)（一）依據(jù)GB4789.4-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》位相變異試驗法之一簡易平板法：將0.35%--0.4%半固體瓊脂平板烘干表面水分，挑取已經(jīng)檢查出來的H鞭毛抗原因子診斷血清1環(huán)，滴在半固體平板表面，放置片刻，待血清吸收到瓊脂內(nèi)，在血清部位的中央點種待檢菌，36℃24h培養(yǎng)后，在形成蔓延生長的菌苔邊緣取菌，用沒有檢測出相對應的沙門氏菌H鞭毛抗原診斷血清檢測H鞭毛抗原（二）改進的沙門氏菌H鞭毛抗原位相變異試驗法：在滴加了1小滴布氏肉湯的小玻璃管中滴加已檢出鞭毛H相對應的沙門氏菌H鞭毛抗原診斷血清1小滴，混勻，從沙門氏菌純培養(yǎng)的營養(yǎng)瓊脂平板上用接種針挑取菌接種到混勻的液體中，36℃24h培養(yǎng)后，用沒有檢測出來的另外一相沙門氏菌H鞭毛抗原診斷血清檢測H鞭毛抗原，二者進行24h培養(yǎng)后H鞭毛抗原檢出的陽性率比較。

1.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 120份樣品中檢出14株沙門氏菌菌株的情況禽 類、禽類的內(nèi)臟、水產(chǎn)品中沙門氏菌檢出陽性率較高，沙門氏菌污染較嚴重。

表1 120份樣品中檢出沙門氏菌菌株的情況

2.2 兩種沙門氏菌純培養(yǎng)方法培養(yǎng)24h后兩相H鞭毛抗原都檢出的陽性率比較P<0.01差異有統(tǒng)計學意義。

表2 兩種沙門氏菌純培養(yǎng)方法培養(yǎng)24小時后檢出兩相H鞭毛抗原的陽性率比較

2.3 兩種沙門氏菌位相變異方法培養(yǎng)24h后H鞭毛抗原檢出的陽性率比較P<0.01差異有統(tǒng)計學意義。

表3 兩種沙門氏菌位相變異方法培養(yǎng)24小時后H鞭毛抗原檢出的陽性率比較

3 討論

非傷寒沙門氏菌病是全球范圍內(nèi)血液感染的主要原因之一，每年發(fā)病率340（210~650）萬的病例（總發(fā)病率49/10萬），發(fā)病人數(shù)也多（190[130~290]萬病例）非洲發(fā)病率最高（227/10萬），發(fā)病人數(shù)也多（190[130~290]萬病例），其中嬰幼兒和青年人受影響最大，病死率為20%，是全球疾病和死亡的主要原因之一[9]。通過對本市120份樣品沙門氏菌檢測情況分析,禽類、禽類的內(nèi)臟、水產(chǎn)品中沙門氏菌檢出陽性率較高,本市食品中沙門氏菌污染較嚴重。沙門氏菌是重要的食源性致病菌,能引起人和動物中毒并引起多種嚴重的疾病,對人類健康造成了巨大危害[10]。有關(guān)報道其中生禽肉中沙門氏菌的檢出率最高為37.5%[11]，如表1本實驗室生禽肉中沙門氏菌的檢出率最高為23.33 %,比報導結(jié)果低,可見沙門氏菌污染食品中生禽肉比較嚴重[12]，而禽肉是人們餐桌上常見的食物，沙門菌是食源性疾病的主要致病菌[13]，沙門氏菌的污染則是嚴重危害公眾健康的大問題[14]。因此提高沙門氏菌檢測鑒定分型效率是十分必需的，改進沙門氏菌H鞭毛抗原檢測方法，提供省時、簡單、高效，低成本的方法，具有重要意義。

對沙門氏菌檢測的研究文獻比較多：沙門氏菌鞭毛抗原及其多樣性研究進展[15]、A novel DNA quantum dots/aptamer-modified gold nanoparticles probe for detection of Salmonella typhimurium by fluorescent immunoassay（新型DNA量子點/適體修飾金納米粒子熒光免疫 探針檢測鼠傷寒沙門菌）[16]、Recombinase Polymerase Amplification(RPA)Combined with Lateral Flow Immunoassay for Rapid Detection of Salmonella in Food（重組酶聚合酶擴增（RPA）結(jié)合側(cè)向流免疫法快速檢測食品中沙門氏菌）[17]等。這些方法快速，但它針對沙門氏菌核酸等分子生物學檢測，有些不能分型檢測，試驗、操作過程等易受環(huán)境污染影響結(jié)果，技術(shù)條件、環(huán)境要求高，需要高精密儀器與設備，成本高，如PCR方法就有局限性,死亡菌體也檢出強陽性[18],不適應疾病預防控制中心等基層醫(yī)療單位應用。我國對沙門氏菌H鞭毛抗原檢測研究的文獻比較少：《搭橋法誘導腸炎沙門氏菌鞭毛抗原及鑒定》[1]、《一株 發(fā)酵乳糖且位相變異的鼠傷寒沙門氏菌的鑒定》[19]、《沙門氏菌血清學分型》[20]。這些方法細菌培養(yǎng)需時長，檢測結(jié)果滯后，操作繁雜、易受污染影響結(jié)果，技術(shù)高、成本高，不很適應基層。

目前，全世界已發(fā)現(xiàn)2500多種沙門氏菌血清型[21]，我國目前發(fā)現(xiàn)一千多種沙門氏菌[22]，且沙門氏菌鞭毛抗原易發(fā)生H—O變異、抗原復雜、多樣性[13]；變異誘導培養(yǎng)經(jīng)常5～6次都難檢出[7]。食品經(jīng)過加工，由于加熱、干燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用、平板含水份過少導致鞭毛發(fā)育不良；培養(yǎng)基中某些成分抑制鞭毛生長；營養(yǎng)成分含量不夠；培養(yǎng)溫度不合適；某些菌株冷凍過久，性狀發(fā)生變異等，這些因素都可能使沙門氏菌的鞭毛丟失或產(chǎn)生困難[1]。沙門氏菌檢測采用GB4789.4-2016分離純培養(yǎng)和位相變異方法，靈敏度低、反復多次所需時間長、消耗試劑多,成本高、操作繁雜、結(jié)果滯后、人員勞動強度大。所以沙門氏菌H鞭毛抗原檢測鑒定方法改進研究，使其方法快速、簡單、低成本、高成功率的誘導表達，提高效率是非常有必要的。

表2 中兩種沙門氏菌純培養(yǎng)方法培養(yǎng)24h后檢出兩相H鞭毛抗原的陽性率結(jié)果比較P＜0.01差異有統(tǒng)計學意義；表3兩種沙門氏菌位相變異方法培養(yǎng)24h檢出H鞭毛抗原的陽性率結(jié)果比較P＜0.01差異有統(tǒng)計學意義。沙門氏菌按照常規(guī)GB4789.4-2016純培養(yǎng)法和鞭毛位相變異法檢測H鞭毛,用普通營養(yǎng)瓊脂平板和半固體瓊脂培養(yǎng),營養(yǎng)成分只有蛋白胨和牛肉浸出粉；而改進法純培養(yǎng)法和H鞭毛位相變異法檢測H鞭毛用的是PCA和布氏肉湯，PCA的營養(yǎng)成分中有胰蛋白胨和酵母浸粉；布氏肉湯的營養(yǎng)成分中有蛋白胨、酵母浸粉、胰酪蛋白胨。PCA和布氏肉湯的營養(yǎng)成分豐富，并含有酵母浸粉，有利于加速細菌發(fā)育繁殖,能刺激沙門氏菌H鞭毛發(fā)育[8],酵母增菌肉湯的液體環(huán)境更有利沙門氏菌H鞭毛生長[8]；實驗中：改進的沙門氏菌純培養(yǎng)方法培養(yǎng)24h后檢出兩相H鞭毛抗原的陽性率為73.33%；改進的沙門氏菌位相變異方法培養(yǎng)24h后檢出H鞭毛抗原的陽性率86.36%。改進的純培養(yǎng)和位相變異的檢出率提高了，檢出時間縮短了，靈敏度提高了，避免了反復轉(zhuǎn)種鑒定都檢不出來的困難,是基層疾病預防控制中心應對突發(fā)公共衛(wèi)生事件迫切需要的；改進的純培養(yǎng)和位相變異法所用的器材：9cm平皿、接種針、吸管培養(yǎng)箱等，試劑都比較簡單、易得、操作簡便、技術(shù)條件簡單，只要高壓滅菌，整個過程注意無菌操作、生物安全。與GB4789.4-2016的方法相比只是多了一種布氏肉湯，不需要增加任何儀器設備和其他試劑。減輕了試劑配制、滅菌、清洗、等環(huán)節(jié)工作量，降低了各環(huán)節(jié)污染風險和實驗室環(huán)境污染風險。是現(xiàn)在物資困乏，任務繁重的基層疾醫(yī)療急需的。所以改進的沙門氏菌純培養(yǎng)和位相變異法技術(shù)操作簡便、檢出率高、成本低、檢出時間短，靈敏度高，具有經(jīng)濟及時間效益,有利于基層醫(yī)療沙門氏菌鑒定技術(shù)的推廣應用。

綜上所述,改進的沙門氏菌H鞭毛抗原純培養(yǎng)和位相變異方法,在24h間內(nèi)H鞭毛抗原檢出陽性率高、檢出時間縮短了、操作簡便、所用的儀器設備簡單,在現(xiàn)有的基層上不需要添加任何儀器設備,試劑少、成本低，比較易得、技術(shù)條件、環(huán)境簡單,減少人員的勞動強度，為基層醫(yī)療提供了省時、簡單、高靈敏度、高經(jīng)濟效益的方法。改進的沙門氏菌H鞭毛抗原純培養(yǎng)和位相變異方法具有推廣應用價值，確保了基層食品的安全，從而提高人們的健康水平,將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。