血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ的變化與肺結(jié)核肺部受累情況及化療預(yù)后的關(guān)系

曾俊風(fēng)，徐瑞峰，朱喜增，盧瑞杰，孫春偉，霍麗亞，張紅謹(jǐn)

（1.南陽(yáng)市中心醫(yī)院感染肝病科，河南 南陽(yáng)473000；2.南陽(yáng)市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 南陽(yáng)473000）

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的傳染病,其發(fā)病與機(jī)體免疫系統(tǒng)有一定關(guān)聯(lián)[1]。MTB感染后，肉芽腫、干酪樣壞死、空洞等癥狀時(shí)有發(fā)生，導(dǎo)致這些病變的機(jī)制仍不完全清楚，有研究顯示[2,3]，機(jī)體受到MTB侵襲后,免疫系統(tǒng)被激活，一些急性反應(yīng)蛋白水平增高，基質(zhì)蛋白酶抑制劑-1(Matrix protease inhibitor,TIM P-1)、蛋白水解酶如(Proline Peptidase,PEPD)水平也可反映結(jié)核病患者病理的改變。Th1/Th2細(xì)胞應(yīng)答在結(jié)核免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用,肺被結(jié)核桿菌感染后使T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被激活,巨噬細(xì)胞活化期間,體內(nèi)將產(chǎn)生大量的炎性遞質(zhì)和細(xì)胞因子[4]。γ-干擾素(interferon-γ,INF-γ)作為Th1型細(xì)胞因子,在機(jī)體的抗結(jié)核免疫反應(yīng)中發(fā)揮一定作用。負(fù)性協(xié)同刺激分子T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T cell immunoglobulin mucin molecule 3,Tim-3),抑制T細(xì)胞的活化和增殖,是一種導(dǎo)致T細(xì)胞功能耗竭的標(biāo)志性分子,全長(zhǎng)的膜型Tim-3(flTim-3)是Tim-3常見(jiàn)的形式[5,6]。大多研究常集中于flTim-3,而對(duì)可溶性T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Soluble T cell immunoglobulin mucin molecule-3,sTim-3）的報(bào)道很少,肺結(jié)核病感染過(guò)程中sTim-3與Th1/Th2之間的關(guān)系不清楚。選取我院傳染病科確診的初治肺結(jié)核患者健康體檢對(duì)象作為研究對(duì)象,并根據(jù)患者影像學(xué)資料分為單肺受累組/雙肺受累組，檢測(cè)患者血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平并與健康者進(jìn)行比較，揭示其與發(fā)病、肺部受累病情及治療結(jié)果判斷的相關(guān)性,闡明其對(duì)肺結(jié)核的輔助診斷、肺部受累病情及治療結(jié)果判斷的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2015年1月-2017年12月確診的98例初治肺結(jié)核患者為病例組、90例健康體檢對(duì)象為對(duì)照組。病例組，年齡27~75歲，平均57.5±12.6歲，男48例、女50例；其中痰涂片陽(yáng)性57例；其中單肺受累41例、雙肺受累57例；所有患者均按照《肺結(jié)核診斷和治療指南》中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范性治療，其中60例為治愈病例（治愈人群和臨床治愈人群）、38例為治療失敗病例（患者經(jīng)過(guò)6個(gè)月的治療，患者影像學(xué)、痰液細(xì)菌學(xué)檢查陽(yáng)性，需要進(jìn)一步延長(zhǎng)治療）。對(duì)照組，年齡23~75歲,平均55.9±11.0歲,男46例、女44例；兩組患者的年齡、性別、比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。入選標(biāo)準(zhǔn)：⑴肺結(jié)核的診斷及治療標(biāo)準(zhǔn)參考《肺結(jié)核診斷和治療指南》；⑵肺結(jié)核患者的臨床療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南》中患者轉(zhuǎn)歸分類標(biāo)準(zhǔn)；⑶所有納入結(jié)核病患者經(jīng)過(guò)痰培養(yǎng)、痰涂片陽(yáng)性或根據(jù)影像學(xué)檢查顯示與活動(dòng)性肺結(jié)核病相似的臨床癥狀(咳嗽、咳痰、咯血等)；⑷本研究符合《赫爾透辛基宣言》相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理規(guī)定，經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴全身感染性疾病；⑵伴有肺部或其他部位的原發(fā)性腫瘤；⑶自身免疫性疾病；⑷長(zhǎng)期使用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素類藥物的患者；⑸既往治療失敗的肺結(jié)核患者。

1.2 血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ檢測(cè)方法治療前分別采集結(jié)核患者及健康體檢者血樣4ml，37℃下促凝0.5h、按要求離心后，取上清置于EP管中置于-80℃冰箱中待測(cè)。

ELISA法檢測(cè)TIMP-1、PEPD、sTim-3的含量[16,17]。將標(biāo)準(zhǔn)蛋白TIMP-1、PEPD、sTim-3分別按照說(shuō)明書(shū)稀釋操作，遵照ELISA試劑盒（購(gòu)自上海鑫樂(lè)生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。最后使用xMark酶標(biāo)儀(購(gòu)自Bio-Rad公司)測(cè)量在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，隨后以標(biāo)準(zhǔn)品濃度值為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)樣本的吸光度值代入,求得血清中TIMP-1、PEPD、sTim-3的濃度。

用CBA法測(cè)定血清中IFN-γ水平，嚴(yán)格按照試劑盒（購(gòu)自BD公司）說(shuō)明書(shū)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，用流式細(xì)胞術(shù)分析,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中IFN-γ濃度。

1.3 治療方案 給予左氧氟沙星（第一三共制藥（北京）有限公司）靜脈滴注，每次0.2～0.3g，2次/d。口服利福平膠囊（沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司生產(chǎn)；國(guó)藥準(zhǔn)字H21021905）0.45g，1次/d。鹽酸乙胺丁醇片（沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司生產(chǎn)；國(guó)藥準(zhǔn)字H210 22349）0.75g，1次/d；異煙肼片（宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；國(guó)藥準(zhǔn)字H42022005）0.3 g，1次/d；治療6個(gè)月。治療后記錄治療結(jié)果，分別檢測(cè)TIMP-1、PEPD、sTim-3、IFN-γ濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平采用±s表示，組間對(duì)比應(yīng)用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料對(duì)比應(yīng)用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組和對(duì)照組的血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比較 病例組患者的血清PEPD、sTim3水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），病例組患者的血清IFN-γ水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）,病例組和對(duì)照組的血清TIMP水平組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；見(jiàn)表1。

表1 病例組和對(duì)照組的血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比較（±s）

表1 病例組和對(duì)照組的血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比較（±s）

組別n PEPD（mU/ml）sTim3（ng/ml）病例組對(duì)照組t值P值98 90 TIMP-1（ng/ml）20178.4±4428.1 18910.2±4817.3 1.881 0.062 1288.5±320.1 844.1±155.8 11.935 0.000 14.66±3.20 6.73±1.84 20.588 0.000 IFN-γ（pg/ml）2.70±0.81 4.83±0.90-17.079 0.000

2.2 不同肺部受累情況的肺結(jié)核患者血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比較 雙肺受累的肺結(jié)核患者的血清TIMP-1、PEPD、sTim3水平顯著高于單肺受累組（P＜0.05），雙肺受累的肺結(jié)核患者血清IFN-γ水平顯著低于單肺受累組（P＜0.05）；見(jiàn)表2。

表2 不同肺部受累情況的肺結(jié)核患者血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比較（±s）

表2 不同肺部受累情況的肺結(jié)核患者血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比較（±s）

肺部受累情況單肺雙肺t值P值n PEPD（mU/ml）sTim3（ng/ml）41 57 TIMP-1（ng/ml）19301.2±3302.1 21061.8±4175.6-2.241 0.027 1017.4±264.0 1512.6±285.1-8.746 0.000 11.85±3.11 17.20±2.94-8.674 0.000 IFN-γ（pg/ml）3.20±0.68 2.26±0.77 6.255 0.000

2.3 不同治療轉(zhuǎn)歸結(jié)局患者血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比較 治療6個(gè)月后，治愈組的血清TIMP-1、PEPD、sTim3水平顯著低于治療失敗組（P＜0.05），治愈組的血清IFN-γ水平顯著高于治療失敗組（P＜0.05）；見(jiàn)表3。

表3 不同治療轉(zhuǎn)歸結(jié)局患者血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比較（±s）

表3 不同治療轉(zhuǎn)歸結(jié)局患者血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平比較（±s）

治療轉(zhuǎn)歸治愈組失敗組t值P值n PEPD（mU/ml）sTim3（ng/ml）60 38 TIMP-1（ng/ml）19076.2±3212.6 20466.0±3521.8-2.010 0.047 940.1±228.7 1172.5±330.4-4.115 0.000 8.40±2.85 12.85±2.17-8.227 0.000 IFN-γ（pg/ml）3.92±0.95 3.11±0.67 4.580 0.000

3 討論

肺結(jié)核病是與機(jī)體免疫相關(guān)的感染性疾病，MTB感染后,肉芽腫、干酪樣壞死、空洞等癥狀時(shí)有發(fā)生。MBT感染后CD4+淋巴細(xì)胞釋放的各種細(xì)胞因子的免疫反應(yīng)可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用，CD4+淋巴細(xì)胞主要分成兩種亞型，即Th1、Th2[7]。

其中INF-γ主要是由Th1細(xì)胞釋放,能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫,增強(qiáng)人體組織抗原II分子在效應(yīng)相關(guān)巨噬細(xì)胞表面的表達(dá)，使Th1細(xì)胞的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，殺死病原微生物的效應(yīng)顯著[8]。研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，肺結(jié)核患者血清中INF-γ水平較低，推測(cè)MTB感染階段可能存在以IFN-γ失衡，Th1細(xì)胞型免疫反應(yīng)受到抑制，抵抗肺結(jié)核的作用減弱。sTim3是負(fù)性共刺激分子，與其相應(yīng)配體結(jié)合后能抑制T淋巴細(xì)胞增殖,對(duì)免疫應(yīng)答起著負(fù)調(diào)控的作用[9,10]。結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者血清中sTim-3水平較對(duì)照組高,而IFN-γ水平較低，提示sTim-3可能參與T細(xì)胞介導(dǎo)的MTB感染期間Th1細(xì)胞型免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)控。肺結(jié)核組sTim-3水平高于對(duì)照組，雙肺損害組也較單肺損害組高，提示sTim-3可能同樣影響機(jī)體CD4+T細(xì)胞的功能，參與肺結(jié)核患者體內(nèi)Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞免疫失衡,從而使機(jī)體殺傷MTB的能力減弱,進(jìn)一步促進(jìn)肺結(jié)核的發(fā)展。

已有研究[11]發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者基質(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9,MMP-9）增高，MMP-9在有肉芽腫的患者中較無(wú)肉芽腫患者高，MMP-9水解并整合基質(zhì)中各種膠原酶和蛋白酶，而TIMP-1可以抑制MMP-9的活性,使其水解各種酶的作用減弱。本研究發(fā)現(xiàn)雙肺損害組TIMP-1水平高于單肺損害組，治療前TIMP-1水平也較治療后高,可能是由于雙肺損害組產(chǎn)生的肉芽腫組織干酪樣壞死和液化情況較嚴(yán)重，PEPD是蛋白水解酶的一種，可以水解肽段羧基端的脯氨酸或羥脯氨酸，可調(diào)節(jié)MTB細(xì)胞質(zhì)外應(yīng)激反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中，結(jié)核病組的PEPD水平高于健康對(duì)照組，這可能是由于免疫球蛋白增加和結(jié)核病患者肉芽腫發(fā)病率導(dǎo)致的。雙肺損傷嚴(yán)重程度高于單肺損傷組。因此，PEPD增加更多。

給予患者治療六個(gè)月后,治愈組的血清TIMP-1、PEPD、sTim3水平顯著低于治療失敗組，治愈組的血清IFN-γ水平顯著高于治療失敗組。乙胺丁醇、異煙肼和利福平是臨床常用的抗結(jié)核藥，療效較好，缺點(diǎn)是毒副作用大，抑菌效果不好，患者較易產(chǎn)生耐藥性[12]。左氧氟沙星第3代的抗菌藥物，抑菌效果顯著,作用于人體后可明顯抑制細(xì)菌脫氧核糖核酸旋轉(zhuǎn)酶的合成,清除肺部存有的結(jié)核分枝桿菌，阻止對(duì)肺部造成傷害；而且左氧氟沙星與血漿蛋白的親和力不足，兩者結(jié)合較困難，所有該藥物能更好地滲透細(xì)胞內(nèi)，減少藥物的消耗，殺菌效果很可觀[13,14]。

尉理梁[15]等的研究顯示，肺結(jié)核病患者血清蛋白與肺結(jié)核病發(fā)病、病理改變存在關(guān)聯(lián),血清TIMP-1、PEPD水平可以反應(yīng)肺結(jié)核病的嚴(yán)重程度。我院不僅對(duì)上述兩種指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè),還對(duì)肺結(jié)核患者免疫細(xì)胞因子水平進(jìn)行了研究,使論據(jù)更加全面，但本研究也有不足的地方，由于研究時(shí)間的限制，病例數(shù)較少、缺乏較長(zhǎng)時(shí)間隨訪及觀察，對(duì)患者治療后一定時(shí)間的情況缺乏了解,忽視了用藥后藥物可能產(chǎn)生的副作用。在接下來(lái)的研究中，需要更大樣本和長(zhǎng)時(shí)間隨訪的支持,進(jìn)一步驗(yàn)證所采用指標(biāo)的臨床價(jià)值。

綜上所述,檢測(cè)血清TIMP-1、PEPD、sTim3、IFN-γ水平對(duì)于肺結(jié)核的輔助診斷、肺部受累病情及治療結(jié)果判斷均具有一定的參考意義。