微小核糖核酸在冠心病患者中的表達及與凝血功能的相關性

李玲，李宗州，路娜

（1.河南省職工醫院 檢驗科，河南 鄭州450000；2.河南省中醫院檢驗科，河南 鄭州450000）

冠心病是指因冠狀動脈血管粥樣硬化病變引起血管腔狹窄、阻塞，造成心肌缺血缺氧、壞死而導致的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病[1]。世界衛生組織將冠心病分為無癥狀心肌缺血、心絞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭、猝死5種類型。現代臨床常分為穩定性冠心病（Stable coronary heart disease，S CAD）與急性冠狀動脈綜合征（Acute coronary syndrome，ACS）[2]。冠心病是由免疫、遺傳、環境等多種因素相互作用導致的一種炎性疾病，與季節變化、大量吸煙飲酒、情緒暴怒、暴食有關，常呈急性發作。表現為胸痛、休克、發紺、盜汗，嚴重者可發生猝死。冠心病發病機制復雜,常見有血栓形成學說、脂肪浸潤學說、內皮損傷學說、炎癥及免疫學說，其中血管內皮損傷學說是被公認且形成較久的冠心病發病學說[3]。有研究顯示微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）與冠心病發生有緊密聯系[4]。miRNA是一類內源性非編碼小分子RNA，種類繁多,可調控細胞增殖分化及凋亡過程[5]。本研究通過觀察冠心病患者血漿中miRNA水平,探究miRNA與冠心病患者凝血功能關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年7月-2018年12月本院收治冠心病患者84例作為觀察組。納入標準：⑴經冠狀動脈造影檢查診斷為冠心病；⑵年齡18~75歲；⑶至少一支冠狀動脈狹窄程度>50%；⑷無血緣關系。排除標準：⑴伴有惡性腫瘤；⑵嚴重肝腎功能障礙；⑶近1月內有輸血史；⑷感染及血液系統疾病；⑸妊娠及哺乳期婦女。另選取同期于我院體檢合格健康者80例作為對照組。觀察組年齡32~71歲,平均52.35±5.28歲，男性54例，女性30例。對照組年齡34~65歲,平均49.51±4.17歲，男性43例,女性37例。根據觀察組冠心病不同類型，分為SACD組53例，ACS組31例。觀察組與對照組年齡、性別基礎資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究獲得醫學倫理委員會批準,所有受試者及家屬對研究內容充分知曉，并自愿簽署知情同意。

1.2方法

1.2.1 標本采集與凝血功能指標測定 觀察組入院第二天清晨空腹抽取靜脈血5ml，對照組于體檢當日抽取同等量靜脈血。采用枸櫞酸鈉抗凝。經低溫離心分離血漿，保存于-80℃冰箱中。采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELIS A)檢測血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復合物（Thrombin antithrombinⅢ,TAT）、血漿纖維蛋白原（fibrinogen，Fg）、D-二聚體（D-dimers）、P-選擇素（P-selectin）水平。

1.2.2 血漿miRNA提取與測定 將血漿從冰箱中取出后置于室溫下融解，轉移至干凈不含RNA酶EP試管中待測。使用miRNA試劑盒（北京百泰克，型號：RP5301）提取血漿中miRNA。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。具體步驟：⑴向EP試管中加入Trizol試劑，混勻置于室溫下5min，加入200μl氯仿，混勻后置于室溫3min，4℃離心15min，吸取上清液至新EP試管。⑵加入異丙醇，混勻，-20℃下孵育30min，4℃離心10min，棄去上清液。⑶洗滌沉淀，4℃離心5min，置于真空5～10min，至不完全干燥狀態，加入焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水30μl溶解沉淀，保存于-80℃冰箱備用。

采用熒光定量PCR技術檢測miRNA。檢測原理：熒光定量PCR指通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記示蹤，監控實時反應過程，建立標準曲線，通過計算機軟件計算待測標本濃度[6]。PCR反應條件：95℃變性5s，60℃退火30s,延伸循環40次。測定前采用美國Bio-RadPCR儀（型號：C1000）將提取好的miRNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄反應條件：37℃60min，95℃3min。逆轉錄完成后，使用美國ABI公司實時定量PCR儀（型號：ABI7500）檢測miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335的Ct值。CT值指每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數，與標本起始濃度呈負相關。

血液采集均由本院檢驗科醫師操作,所有凝血功能相關因子與miRNA提取與檢測均由本院檢驗科持有PCR上崗證書檢驗醫師操作。

1.2.3 評價觀察組中的冠心病患者動脈狹窄程度（Gensini）采用Gensini積分評價體系判斷觀察組患者三支主要冠狀動脈及其分支狹窄程度[7]。評價標準:動脈管腔狹窄≤25%積1分；25～50%積2分；50～75%積4分；75～90%積8分；90～99%積16分；100%積32分。以積分≤25為輕度狹窄（n=32）,26～49為中度狹窄（n=30）,50～100為重度狹窄（n=22）。積分均由冠心病患者主治醫師評定。

1.3 觀察指標⑴SACD組、ACS組及對照組vWF、Fg、TAT、D-dimers、P-selectin水平。⑵SACD組、ACS組及對照組miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335的Ct值。⑶SACD組、ACS組及對照組miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表達量。⑷不同動脈狹窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335的Ct值。⑸不同動脈狹窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表達量。⑹miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335與凝血功能指標及動脈狹窄程度相關性。

1.4 統計學方法 使用SPSS21.0軟件進行數據分析，計量資料組內比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以（±s）表示，相關性分析采用spearman分析法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組受試者vWF、Fg、TAT、D-dimers、P-selectin表達水平比較 SACD組與ACS組vWF、Fg、TAT、D-dimers、P-selectin表達水平比較無顯著差異(P＞0.05)；SACD組與ACS組vWF、Fg、TAT、Ddimers、P-selectin表達水平均明顯高于對照組（P＜0.05），見表1。

2.2 三組受試者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比較 SACD組與ACS組miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比較差異無統計學意義(P>0.05)；SACD組與ACS組miRNA-96、miRNA-34a Ct值均明顯低于對照組（P<0.05）；SACD組與ACS組miRNA-335Ct值高于對照組（P<0.05），見表2。

表1 三組受試者vWF、Fg、TAT、D-dimers、P-selectin表達水平比較

表2 三組受試者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比較

2.3 三組受試者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表達量比較 SACD組與ACS組miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）；SACD組與ACS組miRNA-96、miRNA-34a表達量均明顯高于對照組(P<0.05)；SACD組與ACS組miRNA-335表達量均明顯低于對照組（P<0.05），見表3。

表3 三組受試者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表達量比較

2.4 不同動脈狹窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比較 輕度狹窄組miRNA-96、miRNA-34aCt值高于中度及重度狹窄組，miRNA-335Ct值低于中度及重度狹窄組(P<0.05)；中度狹窄組miRNA-96、miRNA-34aCt值高于重度狹窄組，miRNA-335Ct值低于輕度狹窄組（P<0.05），見表4。

表4 不同動脈狹窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比較

2.5 不同動脈狹窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表達量比較 輕度狹窄組miRNA-96、miRNA-34a表達量均低于重度狹窄組，mi RNA-335表達量高于中度及重度狹窄組(P<0.05)；中度狹窄組miRNA-96、miRNA-34a表達量低于重度狹窄組，miRNA-335表達量高于重度狹窄組（P<0.05），見表5。

表5 不同動脈狹窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表達量比較

2.6 miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335與凝血功能指標動脈狹窄程度相關性 spearman相關分析顯示,miRNA-96、miRNA-34a與vWF、Fg、TAT、TAT、D-dimers、P-selectin及動脈狹窄程度呈正相關（P<0.05）；miRNA-335與vWF、Fg、TAT、TAT、Ddimers、P-selectin及動脈狹窄程度呈負相關（P<0.05），見表6。

表6 miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335與凝血功能指標及動脈狹窄程度相關性

3 結論

miRNA幾乎可參與冠心病患者所有血管內皮細胞、平滑肌細胞基因表達過程[8]。血管內皮細胞具有維持血管內皮完整性、抵御外界危險因子的能力,動脈血管內皮細胞受損是冠心病患者動脈粥樣硬化的首要因素[9,10]。有研究發現冠心病患者血漿中miRNA-96、miRNA-34a水平較其它心血管疾病患者明顯升高[11]。推測冠心病患者動脈粥樣硬化與miRNA-96、miRNA-34a表達水平可能相關，降低其表達量可能可抑制動脈粥樣硬化病變速度。miRNA-335位于7q32.2染色體上，與多種腫瘤發生密切相關[12]。血液中miRNA具有不被RNA酶分解，濃度不受時間、溫度與酸堿度影響的優勢[13]。近年來miRNA作為一種生物標記示蹤物廣泛應用于腫瘤及心血管疾病的臨床研究中[14]。

vWF是血液中一種凝血因子,在血管內皮受損出血時，vWF能介導血小板凝血機制，促進血栓形成。在病理狀態下,vWF異常升高時血栓大量增加，導致凝血功能發生異常。TAT是反映凝血系統激活與凝血酶生成的重要指標，TAT升高常見于血液高凝狀態及血栓性疾病。Fg是纖維蛋白前體，在凝血過程中可促使血液凝固,其病理性升高會引起血栓、心肌梗死、惡性腫瘤。D-dimers是一種纖維蛋白降解產物，其含量與纖維蛋白呈正相關。Pselectin是血管內皮細胞上的一種大分子糖蛋白，主要介導粒細胞、單核細胞與血小板粘附聚集作用，其含量升高會影響血小板粘附聚集功能，使血栓異常增多[15]。vWF、Fg、TAT、D-dimers及P-selectin表達水平異常升高常提示機體凝血功能障礙，均是臨床評估患者凝血功能常用指標。

本研究發現，SACD組與ACS組患者血漿中vWF、Fg、TAT、D-dimers及P-selectin表達量均明顯高于對照組健康者，表明無論何種冠心病，患者都會出現凝血功能障礙情況。分析其原因，可能是由于冠心病發生時因冠狀動脈血管阻塞,血管內皮細胞受損，血液凝血機制被破壞，出現各凝血相關指標表達異常現象。本研究發現，SACD組與ACS組患者miRNA-96、miRNA-34aCt值均明顯低于對照組，miRNA-335Ct值明顯高于對照組；SACD組與ACS組miRNA-96、miRNA-34a表達量均高于對照組，miRNA-335表達量低于對照組。且本研究發現,動脈血管管腔輕度狹窄組中miRNA-96與miRNA-34a表達量均低于重度狹窄組、miRNA-335表達量高于中度及重度狹窄組。表明冠心病患者miRNA-96與miRNA-34a表達量越低、miRNA-335表達量越高，冠心病患者病情越輕，反之病情越重。提示臨床治療時可能通過降低miRNA-96與miRNA-34a表達量、升高miRNA-335表達量，減輕冠心病患者動脈狹窄程度。有研究顯示凝血功能強弱與冠心病血管意外嚴重程度密切相關,冠心病患者動脈狹窄程度越高,其凝血功能障礙情況越重[16]。spearman相關分析顯示,miRNA-96、mi RNA-34a表達水平與各凝血功能指標水平及動脈狹窄程度呈正相關，miRNA-335表達水平與各凝血功能指標及動脈狹窄程度呈負相關。表明高動脈狹窄程度、高凝血功能指標水平的冠心病患者miRNA-96與miRNA-34a表達水平越高，miRNA-335表達越低。

綜上所述，凝血功能指標vWF、Fg、TAT、Ddimers及P-selectin水平異常升高表示凝血功能發生障礙,冠心病患者動脈狹窄程度隨各凝血功能指標水平升高而增大,不同動脈狹窄程度冠心病患者各miRNA均出現表達異常情況。冠心病動脈狹窄程度、凝血功能發生障礙與miRNA-96、miRNA-34a表達量呈正相關,與miRNA-335表達量呈負相關。miRNA表達水平能作為臨床評估冠心病嚴重程度及凝血功能的輔助診斷指標,并為冠心病患者后續治療提供參考價值。