一起由產氣莢膜梭菌和腸聚集性大腸埃希菌共感染導致的聚集性腹瀉事件病原學分析

張 爽，張巍巍，李 穎，馬紅梅，馮寶立，張茂俊，陳 倩，王麗麗

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens，C.perfringene)是一種條件致病菌，能引起人類氣性壞疽和食物中毒等疾病。該菌可產生至少16種毒力因子，包括α-ν 12種毒素、腸毒素、溶血素和神經氨酸酶[1]，其中腸毒素(CPE)和β2腸毒素與胃腸道疾病密切相關[2-3]。腸聚集性大腸埃希菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli，EAEC)是5種致瀉性大腸埃希菌中的一種，曾在世界各發(fā)達和發(fā)展中國家引起散發(fā)或暴發(fā)流行[4-7]，易感染營養(yǎng)不良兒童和免疫力低下的人群[8]。EAEC在本地區(qū)散發(fā)病例中廣泛流行[9]。

本研究對2018年北京市一起腹瀉暴發(fā)事件中分離到的C.perfringens和EAEC進行病原特征分析，為此類混合感染暴發(fā)事件的實驗室應對提供經驗。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1樣本采集與流行病學調查 2018年5月7日北京市某醫(yī)院腸道門診接診9例以腹痛、腹瀉為主要癥狀，有共同就餐史的學生患者。所有病例均來自一個學生團，該團共15人，其中學生14人，生活老師1人，共有9名學生發(fā)病。該團成員均于5月6日晚18點在新疆烏魯木齊就餐，晚20點乘飛機至北京。首發(fā)病例發(fā)病時間為5月7日早3點，末例病例發(fā)病時間為早8點，流行曲線為單峰曲線，呈點源傳播特征。我們采集全部9名病例糞便樣本送至疾病預防控制中心實驗室檢測。

1.1.2試劑與儀器 麥康凱瓊脂(MAC)、胰胨亞硫酸鹽環(huán)絲氨酸瓊脂(TSC)、哥倫比亞血瓊脂(北京陸橋)；細菌 DNA 提取試劑盒(德國Qiagen)；細菌、病毒實時熒光 PCR 檢測試劑盒(北京卓成惠生及青島中創(chuàng))；普通PCR反應液體系液(日本TaKaRa)；限制性內切酶XbaI、SmaI(美國NEB)；革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板(上海星佰)；脈沖場凝膠電泳儀(美國Bio-Rad)；細菌鑒定儀Vitek2 Compact 3.0(法國梅里埃)。

1.2方 法

1.2.1病原體分子篩查 應用北京卓成惠生公司的五種致瀉大腸(貨號A211L)、沙門氏菌(貨號A2060)、志賀菌(貨號A2070)、空腸彎曲菌與結腸彎曲菌(貨號A2242)、副溶血性弧菌(A2050)、輪狀病毒和諾如病毒(貨號A2593)、札如病毒/腺病毒/星狀病毒(貨號A2723)以及青島中創(chuàng)公司的產氣莢膜梭菌(產品編號ZC-RT-PCR-046)熒光定量PCR檢測試劑盒對9份病例糞便核酸進行常見的腸道病原篩查。

1.2.2細菌分離培養(yǎng)和毒力基因檢測 糞便樣本接種MAC瓊脂，37 ℃培養(yǎng)24 h，從平板挑選10個可疑菌落進行5種致瀉性大腸埃希菌毒力基因鑒定[10]，通過熒光定量PCR檢測escV、eae、bfpB、stx1、stx2、lt、st、invE、ipaH、aggR、uidA、astA、pic等基因判定所挑菌落是否為EPEC、STEC/EHEC、EIEC、ETEC、EAEC中的一種；采用傾注法將糞便接種TSC瓊脂，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，挑取10個黑色菌落進行牛奶發(fā)酵等C.perfringens確證實驗[11]，采用普通PCR方法對鑒定為C.perfringens菌株進行6種毒力基因檢測[12]。

1.2.3EAEC菌株的耐藥性檢測 采用微量肉湯稀釋法進行抗生素敏感試驗，依據(jù)CLSI M100-S28判定耐藥、中介、敏感。抗生素包括青霉素類：氨芐西林(Ampicillin, AMP)、芐西林/舒巴坦(Ampicillin/Sulbactam, AM)；一代頭孢：頭孢唑林(Cefazoin, CFZ)；二代頭孢：頭孢西丁(Cefoxitin, CFX)；三代頭孢：頭孢他啶(Ceftazidime, CAZ)、頭孢噻肟(Cefotaxime, CTX)；碳青霉烯類：亞胺培南(Imipenem, IMI)；大環(huán)內酯類：紅霉素(Erythromycin, ERY)、阿奇霉素(Azithromycin, AZM)；四環(huán)素類：四環(huán)素(Tetracycline，TET)；喹諾酮/氟喹諾酮類：萘啶酸(Nudic Acid, NAL)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)；氯霉素類：氯霉素(Chloramphenicol, CHL)；氨基糖苷類：慶大霉素(Gentamicin, GEN)；磺胺類：復方磺胺(Trimeth-sulfame, SXT)；測試抗生素共計包括7大類15種(青霉素類、頭孢類和碳青霉烯類均歸為β內酰胺類)。

1.2.4菌株分子分型檢測 菌株分子分型使用脈沖場凝膠電泳方法(PFGE)，其中EAEC使用XbaI限制性內切酶進行酶切，電泳條件：6.76～35.38 s，19 h；C.perfringens使用SmaI限制性內切酶，0.5～40 s，19 h；兩種方案均以沙門菌H9812使用XbaI酶切后的片段作為分子量參考標準。PFGE圖譜應用BioNumerics 7.6軟件進行聚類分析。

2 結 果

2.1病原初篩、菌株分離及毒力基因檢測結果 9份病例糞便核酸中，6份樣本astA+(EAEC)，8份樣本cpa+(C.perfringens)，5份樣本混合陽性。6份astA+樣本中分離到6株EAEC，且astA+；8份cpa+的樣本中分離到8株C.perfringens，其中2株cpa+/cpe+，6株cpa+/β2+，且8份樣本C.perfringens平板計數(shù)值均>106cfu/g，見表1。

表1 細菌分離培養(yǎng)、毒力基因和PFGE檢測結果

2.2分子分型結果和抗生素敏感性檢測結果 如圖1所示：6株EAEC被分成2種帶型，其中1株為E1帶型，另外5株為E2帶型，E1與E2帶型相似度為70.7%。如圖2所示：8株C.perfringens被分為3種帶型，其中6株(所有cpa+/β2+菌株)為相同帶型C1，2株cpa+/cpe+菌株為2種不同帶型(C2和C3)，C2、C3與C1不成簇，位于另一分支，C2、C3相似度為81.8%。6株EAEC呈現(xiàn)2種耐藥表型，與PFGE帶型分布特征一致，其中5株E2帶型菌為AMP+CAZ耐藥；1株E1帶型菌為AMP+AMS+NAL+SXT多重耐藥。

(注：如圖所示，本事件中分離到的6株EAEC菌株中有5株同源性高達100%，另有1株與其他菌株同源性為70.7%)

(注：如圖所示，本事件中分離到的8株CP菌株中，6株β2毒力基因陽性的菌株聚為1支，同源性為100%；另2株cpe毒力基因陽性的菌株聚為1支，同源性81.8%；2支基因分支間的同源性為54.5%)

3 討 論

C.perfringens在美國作為排在第2位的食源性致病菌[13]，卻多年在國內零報告[14-15]，這可能是腹瀉暴發(fā)疫情中未將C.perfringens納入檢測范圍所導致。本事件對病例糞便進行了多種常見病原的實時熒光PCR檢測，與分離培養(yǎng)起到互相驗證作用。該方法值得在暴發(fā)事件中廣泛應用。9名病例有共同就餐史，發(fā)病潛伏期為8～14 h，既符合致瀉大腸埃希菌導致食物中毒8～44 h的潛伏期特征[16]，也滿足C.perfringens導致食物中毒8～24 h潛伏期特征[17]，同時8個病例糞便C.perfringens計數(shù)均>106cfu/g，與文獻[18]報道符合，不同病例糞便中分別分離到同帶型EAEC和C.perfringens，因此本次腹瀉暴發(fā)事件可能由C.perfringens和EAEC混合感染導致。

文獻報道，CPE腸毒素是引起食物中毒和非食源性人類胃腸道疾病的重要原因[19]，β2腸毒素與人類胃腸道疾病緊密相關[20]。本事件中分離到的C.perfringens均攜帶cpe基因或β2基因，且β2+菌株為同PFGE帶型，說明病例可能被多克隆C.perfringens感染，但實驗者針對每個病例分離的C.perfringens僅保存1株，這可能是個別病例分離株帶型不一致的原因。所有患者(9名)可疑暴露餐次位于新疆烏魯木齊，因此無法對就餐場所環(huán)境和疑似污染食品進行采集，最終導致無法完成食品-環(huán)境-病例的完整溯源。C.perfringens導致食物中毒是否存在多克隆感染值得在今后的工作中持續(xù)關注。建議進行C.perfringens相關暴發(fā)實驗室分析中應挑取并保存多個單菌落，更易于識別患者可能存在的多克隆感染。

EAEC是小兒腹瀉感染的最常見病因，發(fā)展中國家食品中EAEC有較高檢出率，而且也存在無癥狀感染者[21-22]。本次事件有6例患者糞便標本分離到astA+的EAEC，雖然菌株aggR-，仍從病原學上支持6名患者有EAEC感染。6例患者分離到的6株EAEC菌株中，有5株菌PFGE帶型相同、耐藥表型相同，進一步說明患者可能存在著相同克隆的感染。5株PFGE為E2帶型分離株僅對AMP+CAZ耐藥，與北京市致病性大腸埃希菌耐藥譜存在一定差異[23]，這個克隆的菌株在腹瀉患者的感染特征有待于未來進一步地監(jiān)測和分析。

本次暴發(fā)事件中，有5名患者的糞便樣本檢出2種病原，推測可能是2種病原同時污染食品。該結果提示我們在進行實驗室病原檢測分析時，應該盡量全面地篩查有可能引起腹瀉癥狀的各個病原，包括致病細菌和病毒。篩查病原的覆蓋面增大后，可以使我們的實驗室病原檢測結果更為準確、可信，也可以將檢測結果更好地服務臨床的治療工作。類似的多病原混合感染造成的食源性暴發(fā)事件在之前也有報導，這更加提示我們在應對食源性疾病暴發(fā)實驗室分析過程中進行多病原篩查的重要性。

利益沖突：無