皰疹病毒治療性疫苗研究進展

劉 占,馬寧寧,郭子儀,鄧夢夢,史志斌,陳 陸

皰疹病毒科病毒為雙股線性DNA病毒，是引起人與動物疾病的一類重要病原。根據病毒的生物學特性和基因組特點，皰疹病毒科可分為α、β和γ 3個亞科。皰疹病毒典型的感染特征是能夠建立潛伏感染，感染者或康復者長期攜帶病毒，在潛伏感染期間，病毒保持休眠狀態，借以逃避宿主免疫系統的監視。而機體在受到應激后，潛伏的病毒被重新激活，并引起相應的疾病，這一特點使得皰疹病毒感染難以被根治。

治療性疫苗能改善及增強機體對疫苗靶抗原的攝入、表達、處理、遞呈，激活免疫應答，喚起機體對靶抗原的免疫應答能力，達到清除病原體或異常細胞從而治愈疾病的作用。治療性疫苗已在艾滋病[1]、慢性乙型肝炎[2]、腫瘤[3]等多種疾病領域取得較大的進展。目前皰疹病毒感染引發的各類疾病仍以預防性疫苗接種和抗病毒藥物治療為主，無法防止其復發性感染。因此，研發可抑制皰疹病毒復發性感染或清除潛伏感染的治療性疫苗具有重要意義。

1 皰疹病毒潛伏感染與再激活

皰疹病毒最初感染宿主時，病毒粒子通過破損的皮膚、黏膜等侵入機體，隨即在細胞內復制和增殖，在復制期間，皰疹病毒基因組以級聯方式進行相關蛋白的表達。之后嗜神經性子代皰疹病毒侵入神經系統，跨突觸在神經元間傳播，最后沿著神經軸索逆行運輸到神經元胞體并建立潛伏感染。潛伏感染期間，皰疹病毒以嚴格的機制維持潛伏感染狀態，病毒DNA在細胞內以附加體的形式存在，裂解性基因處于轉錄抑制狀態，病毒基因組僅限于潛伏相關轉錄本(Latency-associated transcripts，LAT)的轉錄，被感染的細胞不產生感染性病毒粒子，因而宿主不表現出任何臨床癥狀[4]。具有神經嗜性的皰疹病毒通過潛伏在宿主不進行分裂的感覺神經元細胞中，從而逃避機體免疫系統的監視，僅有極少部分基因仍保持較低水平的表達，以保證病毒能被有效激活。具有淋巴嗜性的皰疹病毒在潛伏感染期間則保證基因組特定基因在其貯存的淋巴細胞特定區域內的轉錄和復制，通過此嚴格調控機制介導病毒逃避宿主免疫系統的監控，且能夠保證被感染細胞不會發生細胞凋亡而導致細胞死亡[5]。潛伏感染期間，當機體免疫水平降低、宿主處于應激狀態時，休眠狀態的病毒被重新激活，病毒裂解性基因大量表達，從而增殖感染性病毒粒子并引發相關疾病。皰疹病毒潛伏感染再激活由一系列機制維持，包括特異的神經因子、病毒因子(如LAT和病毒微小RNA)及對病毒基因組的表觀遺傳學調控[6]。因此，很有必要構建一些不表達特定因子的突變體病毒，并研究其對潛伏感染再激活的影響。

2 皰疹病毒治療性疫苗的目標

多數皰疹病毒可以在機體內建立長期潛伏感染，目前尚無機體免疫可以清除潛伏感染的證據。抗病毒藥物療法雖然在控制復發性皰疹病毒感染上有一定成效，但該法用藥周期長且病毒可能發生變異而產生耐藥性[7]，并不能有效防止病毒復發性感染。皰疹病毒預防性疫苗并不能預防潛伏性感染的建立，且未能有效阻止機體發生復發性感染[8-10]。治療性疫苗的最終目的是能夠激活有效的免疫應答反應，并能產生長期的記憶性細胞反應，可以防止病毒復發性感染，因此，治療性疫苗更具有優勢和應用前景[11]。治療性疫苗是通過誘導或增強特定的免疫功能，增強控制潛伏感染的特異性免疫反應的能力，從而減輕復發性疾病的癥狀和體征以及降低復發率。皰疹病毒復發性感染時不斷刺激相對應的效應淋巴細胞，最終造成這些細胞的耗竭，逐步喪失效應功能、增殖潛力以及分化為免疫記憶細胞的能力。因此研發的治療性疫苗可以刺激這些病毒特異性CD8+T細胞，使之重新增殖形成更多的具有效應功能的特異性CD8+細胞毒性T淋巴細胞群(Cytotoxic T cell，CTL)，進而殺滅病毒感染的細胞。潛伏感染的建立常伴隨著抑制性免疫微環境的形成，因此，皰疹病毒治療性疫苗的研發須著重于調控或逆轉病毒感染造成的抑制性免疫微環境以及提高疫苗誘導形成的效應CD8+T細胞在抑制性免疫微環境下的免疫應答效力。隨著對抗病毒免疫應答認識的不斷深入，人們發現CD4+T淋巴細胞不僅有助于CTL的活化，而且其本身也發揮著多種效應細胞的功能。因此，理想的治療性疫苗應該考慮多種抗原的多價多表位與疫苗組合，在提高疫苗免疫原性方面最大限度發揮CTL抗病毒作用，同時充分發揮其它抗病毒成分的功能。

3 基于T細胞的皰疹病毒治療性疫苗研究進展

多數皰疹病毒發展出多種機制來逃避宿主的免疫應答，并在機體內建立潛伏感染。適應性免疫反應產生的T細胞可以清除病毒感染的細胞且具有特異性及長期免疫記憶能力，鑒于T細胞免疫應答對控制皰疹病毒再激活的重要性，目前研發的皰疹病毒治療性疫苗多數基于誘導T細胞免疫應答的原理而設計。

3.1基于系統性效應T細胞反應的治療性疫苗 T細胞介導的保護性免疫在抗皰疹病毒感染中發揮至關重要的作用，皰疹病毒感染機體后誘導T細胞介導的全身性免疫應答，T細胞受到抗原刺激后，分化、增殖、轉化為效應T細胞，協同細胞因子對抗原進行直接殺傷，因此治療性疫苗的效果與機體誘導系統性T細胞免疫應答反應的強弱和持續時間密切相關。基于此，Bernstein等[12]考慮到治療性單純皰疹病毒 (Herpes simplex virus, HSV)亞單位疫苗的抗原和佐劑選擇在誘導T細胞免疫應答方面的重要性，研發了一種HSV-2治療性疫苗—GEN-003。該疫苗將HSV感染者抗體和CD4+T細胞識別的主要靶抗原gD2與運用高通量蛋白質組學方法鑒定的CD8+T細胞抗原感染細胞蛋白4(infected cell protein 4, ICP4)相結合，并應用了增強免疫反應的佐劑Matrix-M2。由于IFN-γ是反映疫苗誘導有效免疫應答的細胞因子[13]，研究通過IFN-γELISPOT方法檢測疫苗免疫小鼠后T細胞反應的強弱程度，結果證明該疫苗誘導更加強烈持久的系統性T淋巴細胞免疫應答，接種后可減少約50%的疾病復發率。

愛潑斯坦-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus, EBV)與鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)的發生發展密切相關，大多數治療性EBV疫苗的研究都與NPC相關[14]，且EBV的 核抗原1 (Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen 1,EBNA1)和潛伏膜蛋白2(Latent membrane protein 2,LMP2)抗原是免疫治療的靶點。基于T細胞免疫應答在控制皰疹病毒感染過程中的重要性，朱偉等[15]使用含有EBV LMP2與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的融合基因CSF2A重組質粒轉染樹突狀細胞，載有抗原肽的樹突狀細胞遷移至二級淋巴器官，在此激活特異性T細胞免疫應答，誘導活化機體更多的EBV LMP2特異性CTL，具有更強的殺傷EBV腫瘤細胞作用。Taylor等[16]研發了以安卡拉牛痘病毒為載體同時表達部分EBNA1和全長LMP2兩種蛋白的疫苗，并通過IFN-γELISPOT方法檢測抗原特異性T細胞數量變化。結果證實與免疫前相比外周血中特異性CTL 數量提高了數倍，誘導了更高水平的特異性T細胞免疫應答。另外，靶向 EBNA1和LMP2抗原的治療性疫苗在專注于誘導強烈而持續的CTL反應的同時也應注重疫苗誘導的抗原特異性CTL的活性。Ge等[17]利用激光掃描共聚焦顯微鏡和實時無標記細胞分析技術動態監測CTLs介導的靶細胞特異性殺傷能力及殺傷效率，發現重組腺病毒rAd-LMP2疫苗誘導的LMP2特異性CTLs對表達EBV-LMP2的腫瘤細胞具有選擇性的細胞毒性，展現較好的腫瘤細胞殺傷效率。該研究將有助于了解以EBV-LMP2為靶點的治療性疫苗并改進其免疫治療策略以達到更好的臨床效果。

3.2基于局部性記憶T細胞反應的治療性疫苗 皰疹病毒感染后，機體產生CTL和輔助性CD4+T細胞來控制病原體的擴散，并產生記憶細胞。當機體發生復發性感染時，存在感染部位的組織常駐記憶T細胞(Tissue-resident memory T cells，TRM)發生增殖，同時中央記憶T細胞(central memory T cells，TCM)分化出大量外周組織循環效應記憶T細胞(Effector memory T cells，TEM)遷移到感染部位，從而迅速產生強烈的局部性免疫記憶反應，抑制病毒的再激活[18]。因此，治療性疫苗設計的重要策略之一是增加機體TEM和TRM細胞的數量，進而誘導局部強烈持久的T細胞免疫記憶反應。Khan等[19]對HSV-1進行了全基因組分析，篩選出3個激活多功能效應記憶T細胞的HLA-A*0201限制性CD8+T細胞表位肽，并使用3個無癥狀潛伏感染個體的CD8+T細胞表位刺激CD8+T細胞的產生，然后再局部注射趨化因子CXCL10以在三叉神經節部位招募足夠數量的HSV-1特異性T細胞，通過檢測重新激活HSV-1后小鼠眼部的病毒滴度及臨床癥狀的變化，證明了該策略增加潛伏感染HSV-1的HLA-A*0201轉基因小鼠TG部位特異性CD8+TEM和TRM數量并且增強它們的功能，從而有效抑制HSV-1的再激活，減少皰疹性眼病的復發。

機體清除入侵的皰疹病毒后，在淋巴和外周組織均建立了記憶性T淋巴細胞群，然而當機體發生復發性感染時，TEM細胞向皮膚、陰道等外周組織的遷移受到粘附分子和趨化因子受體表達的高度限制[20]。當HSV-2感染患者機體發生復發性感染時TRM細胞最先迅速作出反應，通過分泌IFN-γ控制住病毒的擴散并進一步清除病毒，發揮重要的免疫保護作用[21]。因此，與TEM細胞相比，TRM細胞在機體發生復發性HSV-2感染期間可以更好的增強復發性感染局部免疫力。Bernstein等[22]設計了含有HSV-2糖蛋白gB、gC和gE并加入免疫佐劑CpG的三價亞單位疫苗，該疫苗選擇的3種抗原可以有效地誘導機體產生體液和細胞免疫應答。利用豚鼠模型接種該疫苗誘導強烈的系統性T細胞反應，然后通過局部使用咪喹莫特增加豚鼠背根神經節和陰道黏膜內CD8+TRM細胞數量，從而誘導復發性感染部位更加強烈的局部特異性T細胞免疫反應，進一步增強了HSV-2治療性疫苗的治療效果，顯著降低了生殖器皰疹的復發率。Srivastava等[23]篩選出無癥狀潛伏感染者中被效應CD4+和CD8+T細胞高度識別并具有良好免疫原性的8種HSV-2蛋白，其中由UL40基因編碼的核糖核苷酸還原酶2(RR2)是最具免疫原性的病毒蛋白，選取該蛋白在復發性生殖器皰疹豚鼠模型中探索其免疫原性和保護性效果，結果證實接種含有RR2蛋白的亞單位疫苗后機體產生較高的中和抗體效價，且RR2誘導的抗體與免疫治療糖蛋白(例如gB和gD)發生了交叉反應，該疫苗誘導產生陰道黏膜內功能更強、數量更多的CD4+和CD8+TRM細胞，顯著減少了復發性生殖器皰疹病變和復發頻率。上述研究證明2種特異性記憶細胞在防止皰疹病毒感染性疾病的復發中發揮了關鍵作用，如果可以通過某種治療性疫苗將足夠數量的特異性TEM和TRM細胞招募到機體復發性感染的部位中，則可能永久遏制病毒的再激活。

3.3基于過繼性T細胞療法的治療性疫苗 EBV感染機體后激活B淋巴細胞使其擴增并在此細胞內建立潛伏感染，T細胞免疫反應在EBV免疫治療中具有重要作用，T細胞與EBV的EBNA1、LMP1和LMP2抗原具有較高的親和力，可誘導強烈的特異性CD8+T細胞免疫應答，進而控制病毒感染[24]。因此，可以輸注自體特異性CTL從而提高T細胞殺傷靶細胞的能力，達到更好的免疫治療效果。Smith等[25]利用表達EBNA1、LMP1和LMP2 3種抗原表位的新型腺病毒載體—AdE1-LMPpoly體外刺激擴增EBV特異性CTL進行過繼性T細胞免疫治療，此方法與使用基于淋巴母細胞系刺激擴增EBV特異性T細胞相比[26]，AdE1-LMPpoly載體可快速擴增功能更強的T細胞，然后通過研究擴增T細胞表型與功能特征及治療后臨床癥狀，證明該免疫治療策略誘導了強烈的特異性T細胞免疫應答，具有良好的耐受性、安全性和有效性。免疫功能障礙人群感染EBV后，由于CD8+T細胞功能缺陷，被感染的自身反應性B細胞和漿細胞在中樞神經系統中滯留，從而導致多發性硬化癥的發生。Pender等[27]證明了多發性硬化癥患者腦中EBV感染的B細胞仍然表達上述3種抗原，利用AdE1-LMPpoly載體體外刺激擴增EBV特異性CTL，然后輸注患者體內，通過檢測患者臨床癥狀、腦部損傷情況以及腦脊液IgG含量變化，證明過繼轉移的CD8+T細胞殺死了中樞神經系統中EBV感染的B細胞，從而防止中樞神經系統進一步的自身免疫攻擊。EBV特異性T細胞過繼免疫治療是一種靶向性和無毒性的免疫治療策略，但該方法受到主要潛伏相關基因和蛋白表達譜、HLA限制性以及已知EBV表位的低免疫顯性的限制[28]，因此擴大EBV特異性T細胞表位庫克服其局限性是發展和改進特異性免疫治療策略的主要挑戰。此外，人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)、人類皰疹病毒6型 (Herpesvirus 6, HHV-6)控制病毒感染也主要依賴T細胞免疫，且根據2種病毒感染治療研究進展發現其在研治療性疫苗是基于過繼性T細胞療法而設計，研究證明利用轉移抗原特異性T細胞來建立免疫功能，也可以有效治療HCMV、HHV-6感染，過繼性T細胞治療已成為異基因造血干細胞移植患者HCMV、HHV-6再激活的一種治療方法[29-30]。

4 結論與展望

多數皰疹病毒感染機體后難以被監測和控制，宿主經常會發生復發性感染，治療其復發性感染成為了防控皰疹病毒的關鍵。治療性疫苗能夠激活有效的細胞免疫反應，徹底清除病毒，并能產生長期的記憶性細胞反應，防止皰疹病毒的復發性感染并替代藥物治療。研究皰疹病毒治療性疫苗的模式病毒主要為HSV-1、HSV-2、EBV且多數皰疹病毒治療性疫苗都停留在實驗研究階段，還存在較多問題尚待進一步研究。各亞科皰疹病毒之間具有極其相似的潛伏感染機制，隨著對皰疹病毒結構及功能的深入研究，人們越來越清晰地認識到，皰疹病毒潛伏和激活并非病毒基因獨立促成的，而是病毒、細胞和免疫系統之間相互作用的結果。因此，根據現有皰疹病毒治療性疫苗設計原理，結合皰疹病毒潛伏感染機理及免疫機制的深入研究，可以為其余皰疹病毒治療性疫苗的研發提供方向。皰疹病毒治療性疫苗具有廣闊的應用前景，未來期望可以通過治療性疫苗接種與其他形式的免疫治療方法相結合將免疫治療方法納入皰疹病毒標準治療方案。

利益沖突：無