一種未知真菌性葉斑病發病煙葉真菌群落分析

向立剛 汪漢成鄭蘋 蔡劉體 余知和

摘? 要：為了解貴州省福泉市一未知煙草葉斑病的病原，采用Illumina Miseq高通量測序技術分析了健康與發病煙葉真菌群落結構與多樣性差異。結果表明，煙葉發病后葉際真菌群落結構改變，豐富度與多樣性降低。發病煙葉真菌群落Sobs指數、Ace指數、Chao1指數和Shannon指數整體低于健康煙葉，Simpson指數整體高于健康煙葉。差異顯著性分析表明，健康煙葉組樣品真菌群落數在綱（p=0.027）、目（p=0.035）、科（p=0.026）、屬（p=0.021）、種（p=0.029）和OTU（p=0.038）水平均顯著高于發病煙葉組樣品。Students t 檢驗結果表明，Boeremia屬、紅酵母屬Rhodotorula和Unclassified_c_Dothideomycetes屬在健康煙葉與發病煙葉中相對豐度均存在顯著性差異。其中發病煙葉中Boeremia為最優勢菌屬，健康煙葉中紅酵母屬為最優勢菌屬。推測該未知真菌性煙草葉斑病可能是由Boeremia屬真菌導致。

關鍵詞：煙草葉斑病;真菌病害;Illumina高通量測序;葉際真菌群落

Abstract： In order to identify the pathogen of an unknown fungal tobacco leaf spot disease in Fuquan City， Guizhou Province. Illumina Miseq high-throughput sequencing technology was used to analyze the differences of fungal community structure and diversity between healthy and diseased tobacco leaves. The results showed that after tobacco leaves were infected by this disease， the fungal community structure changed， and the fungal community richness and diversity decreased. Sobs index， Ace index， Chao1 index and Shannon index of the fungal community in diseased tobacco leaves were lower than that of healthy tobacco leaves， while Simpson index was higher than that of healthy tobacco leaves. Notability analysis showed that fungal community of healthy tobacco group was significantly higher than that of diseased tobacco group in class （p = 0.027）， order （p = 0.035）， family （p = 0.026）， genus （p = 0.021）， species （p = 0.029） and OTU （p = 0.038）. The results of Students t test showded that the relative abundance of Boeremia， Rhodotorula and Unclassified_c_Dothideomycetes were significantly different in healthy and diseased tobacco leaves. Among them， Boeremia was the most dominant genus in the diseased tobacco leaves， and Rhodotorula was the most dominant genus in the healthy tobacco leaves. It is speculated that the unknown fungal leaf spot of tobacco may be caused by Boeremia.

Keywords： tobacco leaf spot disease; fungal diseases; illumina high-throughput sequencing; phyllosphere fungal community

作為一種以收獲葉片為目的的經濟作物，煙草葉斑類病害的防治在煙草病蟲害防治中占據重要地位。每年因各類葉斑病害對煙草行業造成的經濟損失高達數億元。2019年7—8月，貴州省福泉市煙區大面積爆發一種煙草葉斑病，據不完全統計該病害為害面積高達80 hm2。病害發生初期葉片上首先出現黃褐色小斑點，隨后發展成為圓形或者近圓形的褐色斑點[1]，初期發病癥狀與煙草赤星病高度相似，但是發病后期無同心輪紋的特點又不同于赤星病。為進一步確定發病原因以采取針對性措施，有必要對其病原菌進行鑒定。

目前對于病原菌的鑒定較為常用的是以柯赫氏法則為核心的傳統分離培養法[2-3]，但其只適用于病原菌為可培養菌群且為一菌一病的病害鑒定，而不適合由不可培養病原菌或多種病原菌復合侵染引起的病害鑒定。目前可培養微生物只占自然界全部微生物的1%左右[4]，而能夠致病的可培養病原微生物比例則更低，因此傳統分離培養法在不可培養致病菌的鑒定上缺乏優勢。相較傳統分離技術，高通量測序技術可直接鑒定出不同微生態環境中的絕大多數微生物，且試驗周期更短。目前將高通量測序技術運用到植物病害微生態的研究也越來越多，如羅路云等[5]研究發現南瓜白粉病菌可以改變南瓜葉際細菌群落結構，隨著南瓜白粉病病情等級的增加，其葉際細菌群落多樣性指數呈先降后增的趨勢。尹淑麗等[6]研究表明黃瓜噴施枯草芽孢桿菌發酵液可有效抑制黃瓜葉際真菌數量。劉暢等[7]發現煙株感赤星病后煙葉上主要優勢真菌為赤星病病原菌鏈格孢屬。此類研究表明葉斑類病害的出現往往伴隨著葉片微生物群落失衡、有益菌豐度降低、病原菌大量增殖成為優勢菌群等現象。通過分析發病葉片微生物豐度的增減，可推測與病原菌存在協同或拮抗作用的微生物群體，為病害的生物防治提供參考。

本研究運用高通量測序技術，旨在明確該葉斑病是否為鏈格孢真菌引起的煙草赤星病，并探明病害發生所引起的煙葉真菌群落結構變化情況以及健康與發病煙葉中據有統計學差異的生物學標識，以期為該病害的防治提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 樣品采集

2019年8月于貴州省福泉市嚴重爆發未知葉斑病的煙田進行采樣（種植品種K326）。在煙田中隨機選取3株發病嚴重的煙株，每株上采集典型發病葉片和未見癥狀的健康葉片各一片。用經75%酒精消毒的剪刀剪取葉片上的病斑，同時采集健康葉片相同部位的葉肉作為對照。發病組（XB）3個樣本的編號分別為XB1、XB2和XB3，健康組（XJ）3個樣本的編號分別為XJ1、XJ2和XJ3。

1.2? DNA提取及目標片段PCR擴增

稱取0.5 g煙葉樣品，采用植物組織DNA試劑盒（Qiagen， 69104）提取總DNA，具體步驟按其操作說明進行。提取出的DNA采用超微量分光光度計NanoDrop 2000檢測其濃度與純度。檢測合格的DNA用于目標片段ITS1區的擴增，擴增引物為ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'），PCR擴增體系與反應程序參考向立剛等[8]的方法。擴增成功的樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumina Miseq高通量測序，測序后的生物信息學分析均在美吉I-Sanger生信云平臺（http：//www.i-sanger.com/project/index.html）完成。

2? 結? 果

2.1? 序列數據質控及OTU聚類分析

稀釋曲線（Rarefaction curve）展示了不同樣品間多樣性的差異，用于檢查測序結果是否合理。橫坐標為該樣本的測序Reads數。本試驗中6個樣本的稀釋曲線在樣本Reads數為30 000時就趨于平緩（圖1），表明測序趨于飽和，測序深度覆蓋到樣品中絕大多數的物種，足以反映樣品中真菌的實際組成情況。

本試驗中6個樣本共得到212 043條高質量序列片段，50 653 810個堿基，單一樣本序列數在31 890～39 974條之間，序列平均長度為239 bp。發病煙葉3個樣本共得到101 379條高質量序列片段，23 873 339個堿基，單一樣本序列數在32 204～35 746條之間，序列平均長度為236 bp。健康煙葉3個樣本共得到110 664條高質量序列片段，26 780 471個堿基，單一樣本序列數在31 890～39 974條之間，序列平均長度為242 bp。

在97%的相似度水平對樣品序列進行OTU聚類（表1），結果表明，發病煙葉樣本共鑒定到真菌4個門，13個綱，22個目，31個科，43個屬，52 個種，66個OTU;健康煙葉樣本共鑒定到真菌5個門，23個綱，47個目，78個科，122個屬，164個種，252個OTU。健康煙葉真菌群落數除門水平外（p=0.678），在綱（p=0.027）、目（p=0.035）、科（p=0.026）、屬（p=0.021）、種（p=0.029）和OTU（p=0.038）水平上均顯著高于發病煙葉。

2.2? 真菌群落基本組成及多樣性分析

2.2.1? 群落基本組成分析? 樣本真菌群落組成結果表明（圖2），發病煙葉組樣本中Boeremia為最優勢菌屬，在XB1、XB2和XB3中的相對豐度分別為87.73%、94.48%和97.30%。XB1中相對豐度大于1%的物種還有Unclassified_f_Mycosphaerellaceae（6.53%）、紅酵母屬Rhodotorula（2.22%）和莖點霉屬Phoma（1.52%）;XB2中相對豐度大于1%的還有莖點霉屬（1.73%）和鏈格孢屬Alternaria（1.98%），XB3中Unclassified_f_Incertae_sedis_o_Pleosporales相對豐度為1.57%。健康煙葉組樣本XJ1中相對豐度大于1%的物種有紅酵母屬（41.78%）、Unidentified_c_Exobasidiomycetes（11.14%）、擲孢酵母屬Sporobolomyces（9.01%）、Unclassified_f_Incertae_sedis_o_Pleosporales（5.35%）、莖點霉屬（5.61%）、Boeremia（5.06%）、Tilletiopsis（3.77%）、Unclassified_f_Davidiellaceae（3.25%）、Unclassified_f_Mycosphaerellaceae（2.66%）、Unclassified_c_Dothideomycetes（2.53%）、Stagonosporopsis（2.39%）;XJ2中相對豐度大于1% 的物種有Boeremia（64.05%）、紅酵母屬（30.66%）、Unclassified_f_Incertae_sedis_o_Pleosporales（1.31%）;XJ3中相對豐度大于1%的物種有：紅酵母屬（51.51%）、漆斑菌屬Myrothecium（8.59%）、莖點霉屬（8.45%）、擲孢酵母屬（7.12%）、Unclassified_f_Davidiellaceae（4.39%）、Stagonosporopsis（3.59%）、Unclassified_f_Incertae_sedis_o_Pleosporales（3.31%）、Unidentified_c_Exobasidiomycetes（2.91%）、Unclassified_f_Mycosphaerellaceae（1.67%）、Unclassified_c_Dothideomycetes（1.51%）、高氏白粉菌屬Golovinomyces（1.57%）。

2.2.2? Alpha多樣性分析? 各樣本Alpha多樣性指數見表2，健康煙葉組樣本真菌的豐富度指數中Chao1指數（p=0.094）高于發病煙葉組樣本，Sobs指數（p=0.038）顯著高于發病煙葉組樣本，Ace（p=0.597）指數中除發病煙葉XB1樣本的指數高于同株的健康煙葉XJ1樣本外，其余兩樣本的Ace指數均低于同株健康煙葉樣本，此結果表明健康煙葉樣本的真菌群落豐富度整體高于發病煙葉樣本真菌群落。多樣性指數中健康煙葉樣本的Shannon指數均高于發病煙葉組（p=0.300），Simpson指數顯著低于發病煙葉組（p=0.006），表明健康煙葉組真菌群落多樣性高于發病煙葉組。

2.2.3? Beta多樣性分析? 屬水平的主成分分析結果表明（圖3a），導致兩組樣本間真菌群落結構產生差異的主要因素PC1和PC2分別占全部影響因素的94.79%和4.45%，健康煙葉樣本與發病煙葉樣本間真菌群落結構存在顯著性差異。健康煙葉組內3個樣本間樣本距離較大，發病煙葉組內3個樣本間樣本距離較小。ANOSIM相似性分析結果與PCA分析結果一致（圖3b），健康煙葉樣本組內各樣本間真菌群落結構差異較大，發病煙葉樣本組內各樣本間真菌群落結構差異較小，兩組樣本的組內差異均小于組間差異。

2.3? 組間物種差異分析

2.3.1? LEfSe物種差異分析? LEfSe是一種用于發現高維生物標識特征的軟件，先使用non-parametric factorial Kruskal-Wallis sum-rank test（非參數因子克魯斯卡爾—沃利斯秩和檢驗，K-W檢驗）檢測 并找到具有顯著豐度差異特征的類群，然后采用線性判別分析（LDA）來估算每個組分豐度對差異效果影響的大小。LEfSe物種差異判別分析結果表明，在LDA閾值為4的條件下，健康煙葉組與發病煙葉組樣本共有22個不同分類水平的真菌存在顯著性差異（圖4）。其中發病煙葉組中Boeremia屬、Incertae_sedis_o_Pleosporales科、座囊菌綱Dothideomycetes、假球殼目Pleosporales和子囊菌門Ascomycota，健康煙葉中擔子菌門Basidiomycota、Microbotryomycetes綱、Incertae_sedis_o_ Sporidiobolales科、鎖擲酵母目Sporidiobolales、紅酵母屬等，是導致發病煙葉與健康煙葉真菌群落產生差異的主要類群。

2.3.2? Students t檢驗? 采用Students t檢驗對兩組樣品間真菌群落進行分析（圖5），結果表明，Boremia作為發病煙葉上的優勢菌屬在健康與發病煙葉中的豐度存在顯著性差異;Unclassified_c_ Dothideomycetes雖然在兩組樣本中相對豐度較低，但也存在顯著性差異;健康煙葉中的優勢菌屬紅酵母屬在兩組樣本中的相對豐度則達到了極顯著差異水平。

3? 討? 論

葉斑類病害多由病原菌在葉際的定殖導致。研究表明植物病害會使病原菌富集，有益菌群數量急劇降低，最終導致植物體微生物群落結構失衡，多樣性水平降低[9-12]。本研究中發病煙葉上真菌群落結構演變規律與前人研究結果一致。健康煙葉組樣品真菌群落數除門水平外，在綱、目、科、屬、種和OTU水平均顯著高于發病煙葉組樣品。Alpha多樣性指數中健康煙葉樣本的Sobs指數和Chao1指數顯著高于發病煙葉樣本，Simpson指數顯著低于發病煙葉樣本，Ace指數和Shannon指數高于發病煙葉樣本但無顯著性差異。Beta多樣性分析結果表明，發病煙葉上真菌群落結構差異較小，健康煙葉真菌群落結構差異較大，且發病煙葉組群落差異小于健康煙葉組。

組間群落組成差異顯著性檢驗中，Boeremia屬、紅酵母屬和Unclassified_c_Dothideomycetes屬在健康煙葉與發病煙葉中相對豐度均存在顯著性差異。其中發病煙葉上最優勢菌屬均為Boeremia。研究表明，Boeremia可導致多種植物感病，如大豆莖點霉葉斑病[13]，秋葵葉斑病和果斑病[14]，婆婆納葉斑病[15]，薄荷黑莖根腐病[16]等，因此推測福泉市2019年爆發的煙草葉斑病是由Boeremia屬真菌導致，而非鏈格孢屬真菌引起的煙草赤星病。紅酵母屬在健康煙葉上為絕對優勢菌屬，其在健康葉上的相對豐度顯著高于發病煙葉，且紅酵母屬真菌似乎與Boeremia屬存在此消彼長的趨勢，是紅酵母屬的消減導致Boeremia屬相對豐度增加，還是Boeremia屬的增加導致紅酵母屬相對豐度降低，或是紅酵母屬對Boeremia屬存在拮抗作用，導致高豐度的紅酵母屬葉片對該葉斑病有抵御能力，目前尚不清楚，該問題將在后續研究中加以解決。Unclassified_c_Dothideomycetes菌屬相對豐度同樣也是健康煙葉中高于發病煙葉，且發病煙葉中的相對豐度小于1%，有可能起到了與紅酵母屬類似的作用，具體機制有待于進一步研究。

本研究中，健康煙葉XJ1和XJ2樣本上也出現Boeremia，且在XJ2樣本中為最優勢菌屬，但葉片卻未出現類似發病煙葉上的病癥。這進一步證明，病原菌富集只是導致植物發病的第一步，而當富集達到一定程度，致使微生物群落結構失衡、多樣性水平降低，不足以對抗病原菌的破壞，才是葉片發病的最終原因。

除了Boeremia菌屬外，健康煙葉與發病煙葉上也檢測到了莖點霉屬Phoma，該菌可導致莖點霉葉斑病[17];健康煙葉樣本XJ3中檢測出高氏白粉菌屬Golovinomyces，其為煙草白粉病的主要病原菌[18]，發病樣品XB3中檢測出赤星病病原鏈格孢屬。此結 果表明，除導致煙葉發病的主要病原菌Boeremia外，其余可使煙葉致病的病原菌也可存在于葉片，可能因為病原菌數量未達到致病數量級，而葉片未表現出相應病癥，因此在煙葉未發病前，對其進行x廣譜性殺菌劑噴霧預防十分必要。

4? 結? 論

研究表明，新型葉斑病煙葉真菌群落豐富度與多樣性均低于健康煙葉。發病煙葉中Boeremia為優勢菌屬，健康煙葉中紅酵母屬為優勢菌屬且組間差異顯著，推測該葉斑病可能為Boeremia菌屬引起的新型病害，而非鏈格孢菌引起的煙草赤星病。但目前尚未有Boeremia菌屬在煙草上致病的報道。此結果將有助于煙農對癥用藥，并有效防控此新型葉斑病。本研究下一步將對病原菌進行分離和藥劑篩選試驗，以期篩選出能夠高效防控該病害的藥劑。

參考文獻

[1]牛俊軻，盧寶慧，劉麗萍，等. 吉林省和黑龍江省煙草赤星病病原鑒定[J]. 中國煙草科學，2019，40（5）：52-59.

NIU J K， LU B H， LIU L P， et al. Identification of the pathogens causing tobacco brown spot disease in Jilin and Heilongjiang Provinces [J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（5）： 52-59.

[2]陳江華，王軒軒，崔雪婧，等. 柑橘根霉軟腐病的病原菌分離與鑒定[J]. 植物病理學報，2020，50（3）：255-260.

CHEN J H， WANG X X， CUI X J. Identification of Rhizopus soft rot of citrus[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2020， 50（3）： 255-260.

[3]馬國勝， 高智謀. 煙草黑脛病菌對農田草本植物的寄主范圍[J]. 植物保護學報，2011，38（5）：477-478.

MA G S， GAO Z M. The host range of Phytophthora nicotianae var. nicotianae in field herbs[J]. Journal of Plant Protection， 2011， 38（5）： 477-478.

[4]ALAIN K， QUERELLOU J. Cultivating the uncultured： limits， advances and future challenges[J]. Extremophiles， 2009， 13（4）： 583-594.

[5]羅路云，張卓，金德才，等. 南瓜白粉病不同病情等級下葉際細菌群落結構和多樣性[J]. 植物病理學報，2017，47（5）：688-695.

LUO L Y， ZHANG Z， JIN D C， et al. Phyllosphere bacterial diversities and community structures on pumkin with different severities of powdery mildew [J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2017， 47（5）： 688-695.

[6]尹淑麗，孫勁沖，劉倩倩，等. 枯草芽孢桿菌BSD-2對黃瓜葉際微生物數量及菌群結構的影響[J]. 微生物學通報，2016（12）：2635-2643.

YIN S L， SUN J C， LIU Q Q， et al. Effects of Bacillus subtilis BSD-2 on cucumber phyllosphere microorganism community [J]. Microbiology China， 2016， （12）： 2635-2643.

[7]劉暢，汪漢成，謝紅煉，等. 感赤星病煙葉的真菌群落結構分析[J]. 貴州農業科學，2019，47（7）：54-59.

LIU C， WANG H C， XIE H L， et al. Fungal community structure analysis of tobacco leaf infected with brown spot disease [J]. Guizhou Agricultural Sciences， 2019， 47（7）： 54-59.

[8]向立剛，汪漢成，郭珍妮，等. 黑脛病感染對煙草莖稈及根際土壤真菌群落結構的影響[J]. 菌物學報，2019（12）：2099-2111.

XIANG L G， WANG H C， GUO Z N， et al. The influence of black shank disease infection on fungal community structure of rhizosphere soil and stem of tobacco plants [J]. Mycosystema， 2019（12）： 2099-2111.

[9]賀紀正，李晶，鄭袁明. 土壤生態系統微生物多樣性-穩定性關系的思考[J]. 生物多樣性，2013，21（4）： 412-421.

HE J Z， LI J， ZHENG Y M. Thoughts on the microbial diversity - stability relationship in soil ecosystems[J]. Biodiversity Science， 2013， 21（4）： 412-421.

[10]張笑宇，段宏群，蘆阿虔，等.健康煙田與易感黑脛病煙田煙株不同生長時期根際土壤微生物區系變化規律[J]. 河南農業科學，2018，47（3）：63-69

ZHANG X Y， DUAN H Q， LU A Q et al. Variation of rhizosphere soil microbial flora in healthy and black shank-susceptible tobacco fields at different growth stages[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences， 2018， 47（3）： 63-69.

[11]施河麗，向必坤，譚軍，等. 煙草青枯病發病煙株根際土壤細菌群落分析[J]. 中國煙草學報，2018，24（5）：57-65.

SHI H L， XIANG B K， TAN J， et al. Analysis of bacterial community in rhizosphere soil of bacterial wilt diseased tobacco plant [J]. Acta Tabacaria Sinica， 2018， 24（5）： 57-65.

[12]陳乾麗，李忠，汪漢成，等. 烤后不同霉變程度煙葉葉際真菌群落組成與多樣性分析[J]. 微生物學報，2019，59（12）：2401-2409.

CHEN Q L， LI Z， WANG H C， et al. Fungal composition and diversity of tobacco phyllosphere from cured tobacco leaves[J]. Acta Microbiologica Sinica， 2019， 59（12）： 2401-2409.

[13]王夢奇，白慶榮，王大川，等. 吉林省大豆莖點霉葉斑病病原鑒定[J]. 大豆科學，2019，38（3）：428-433，454.

WANG M Q， BAI Q R， WANG D C， et al. Pathogen identification of soybean leaf spot caused by Boeremia exigua var. exigua in Jilin province [J]. Soybean Science， 2019， 38（3）： 428-433， 454.

[14]ZHAO Q， XIE X W， SHI Y X， et al. Boeremia leaf and fruit spot of okra caused by Boeremia exigua in China [J]. Canadian Journal of Plant Pathology， 2016， 38（3）： 395-399.

[15]MICHEL V V， DAEPP M， WOUDENBERG J H C， et al. First report of Boeremia exigua var. exigua causing stem and leaf spot on Common Speedwell in Switzerland[J]. Plant Disease， 2018， 102（2）： 440-440.

[16]ZIMOWSKA B， KR?L E D， FURMA?CZYK A， et al. Molecular characterization of Boeremia strasseri the causal agent of black stems and rhizomes rot of peppermint[J]. Journal of Plant Pathology， 2018， 100： 13-24.

[17]江燕，桑維鈞，曾爾玲，等. 煙草莖點病在在貴州省的發生及病原鑒定[J]. 江蘇農業科學，2018，46（10）：92-95.

JIANG Y， SANG W J， ZENG E L， et al. Identification of pathogenic fungus causing tobacco black spot stalk in Guizhou Province[J]. Jiangsu agricultural sciences， 2018， 46（10）： 92-95.

[18]COLE J S. Powdery mildew of tobacco （Erysiphe cichoracearum DC.） [J]. Annals of Applied Biology， 1964， 54（3）： 291-301.