晾制密度對雪茄煙葉非揮發性有機酸代謝的影響

盧紹浩 張嘉雯 趙喆 趙銘欽 鐘秋 宋朝鵬 張瑞娜 張華述

摘? 要：為明確晾制密度對雪茄煙葉非揮發性有機酸代謝的影響，以德雪1號為試驗材料，研究了竿距15、25和35 cm的晾制密度對晾房溫濕度、葉片含水率、化學成分、非揮發性有機酸含量以及蘋果酸脫氫酶（MDH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）和檸檬酸合酶（CS）活性的影響。結果表明，隨著晾制的進行，各處理含水率和蘋果酸含量均呈下降趨勢，檸檬酸和丙二酸含量呈上升趨勢，草酸含量整體變化不大;MDH活性先升高后降低，CS活性一直升高，而SDH活性逐漸降低。晾制過程中，在竿距25 cm的晾制密度下，晾房內溫濕度適宜，能提高雪茄煙葉MDH、SDH和CS活性以及檸檬酸和草酸含量，降低蘋果酸和丙二酸含量，并且晾制后各化學成分較協調。因此，雪茄煙葉在晾制過程中，將晾制密度控制在竿距25 cm能提高煙葉非揮發性有機酸代謝能力，促進煙葉內在物質轉化，提高煙葉品質。

關鍵詞：晾制密度;雪茄煙葉;非揮發性有機酸;酶活性;化學成分

Abstract： In order to clarify the effect of air-drying density on non-volatile organic acid metabolism of cigar tobacco leaves， taking Dexue No.1 as the test material， the effects of three treatments （stick distance of 15， 25 and 35 cm） on the temperature and humidity of the drying room， tobacco leaf moisture content， the chemical composition， the content of non-volatile organic acids， and the malate dehydrogenase （MDH）， succinate dehydrogenase （SDH） and citrate synthase （CS） activities were studied. The results showed that with the progression of air-curing， the moisture content and malic acid content showed a downward trend， the citric acid and malonic acid contents showed an upward trend， and the overall change of the oxalic acid content was not significant. The activity of MDH increased first and then decreased， CS activity increased all the time， while SDH activity gradually decreased. Under the drying density of 25 cm， the temperature and humidity in the drying room were suitable， which can increase the MDH， SDH and CS activities and the contents of citric acid and oxalic acid， reduce the contents of malic acid and malonic acid of tobacco leaves， and the chemical components were coordinated. Therefore， the air-curing density with a length of 25 cm can improve the metabolism of non-volatile organic acids， promote the conversion of internal materials， and improve the quality of tobacco leaves.

Keywords： air drying density; cigar tobacco leaf; non-volatile organic acid; enzyme activity; chemical composition

有機酸在煙草生長發育過程中起著重要作用，它們既是合成大分子的中間物質，也是呼吸作用的中間產物[1]。其中，煙草中的非揮發性有機酸是影響煙草吸食品質的主要化學成分，尤其是蘋果酸、檸檬酸、草酸和丙二酸，它們占煙葉總質量的5%～10%，并且可與金屬離子結合成鹽或脂類形式，降低煙葉重金屬的毒害[2]，同時在燃吸時可平衡煙氣酸堿度，減輕刺激性，提高吸味醇和度[3]。賴燕華等[4]研究表明，丙二酸對卷煙感官品質起負面作用，草酸和檸檬酸起正面作用。張錦韜等[5]通過灰色關聯分析表明，草酸主要影響刺激性和勁頭，蘋果酸主要影響勁頭和濃度，檸檬酸主要影響刺激性和濃度。因此合理調控煙葉內各非揮發性有機酸含量，對提高煙葉內在質量及感官品質具有重要意義。雪茄煙是一種直接由煙葉卷制而成的特殊的煙草類型，優質的雪茄煙葉是卷制高品質雪茄的基礎，其內在物質含量直接決定了雪茄煙的吸食品質[6]。煙草調制是煙葉內在化學成分轉化的關鍵時期，不同的調制措施對煙葉內含物質的轉化可產生不同效果。晾制密度是雪茄煙葉調制管理中的一項重要技術措施，可通過改變煙葉間隙來影響煙葉的失水速率及溫濕度，從而影響煙葉酶活性，最終對內含物質進行調節[7]。目前，調制措施對煙草有機酸的研究主要集中在烤煙和白肋煙方面[8-9]，但關于雪茄煙葉有機酸代謝研究甚少。本試驗將通過探究不同晾制密度對雪茄煙葉有機酸代謝規律及相關酶活性的影響，為優化雪茄煙葉調制工藝及提高雪茄煙葉品質奠定理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 試驗田概況

試驗于2019年在四川省什邡市大泉坑村雪茄煙葉生產基地（東經104°09′，北緯31°18′，海拔539 m）進行。試驗田土壤為水稻土，有機質含量34.35 g/kg，堿解氮含量118.47 mg/kg，速效鉀含量83.69 mg/kg，速效磷含量35.28 mg/kg，pH 6.34。

1.2? 試驗設計

選用當地主栽品種德雪1號為試驗材料，于2019年4月30日移栽，行距120 cm，株距40 cm，按照當地優質雪茄煙葉生產技術規范統一管理，煙田施氮量為180 kg/hm2（煙草專用復合肥），最終使m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶0.5∶3。采收時選取大田葉片長勢和成熟度相對一致的煙株，以中部葉（第10～12葉位）為試驗材料，將采摘后的煙葉編竿掛入晾房，掛竿長200 cm，每竿掛45片煙葉，每個處理煙葉標記30竿，按相鄰兩竿間距設置3個處理：15 cm高密度（M1）、25 cm中密度（M2）、35 cm低密度（M3），將各處理分別掛入3座相同晾房的同一區域（晾房規格為：長×寬×高=30 m×10 m×8 m），采用避光晾制，重復3次。雪茄煙葉晾制分為凋萎期、變褐期、定色期和干筋期4個時期，在晾制第0、5、10、15和20天進行取樣，共取5次。每次選取各處理煙葉30片分成3份，1份用于煙葉含水率的測定;1份用于相關酶活性的測定;1份去除主脈和葉尖殺青后，將其烘干磨碎過60目篩，用于化學成分的測定。

1.3? 測定指標與方法

1.3.1? 溫濕度測定方法? 晾制開始時，將Deli9012溫濕度計（寧波得力電子商務有限公司）掛入每個密度處理的中心處，共掛9個，分別在晾制0、5、10、15和20 d的8：00—20：00時間段內，每隔4小時記錄溫濕度計上的讀數。

1.3.2? 含水率測定方法? 將整片煙葉葉尖處1/3和葉基處1/3去除，放入（100±1）℃的烘箱中，采用烘箱法[10]測定雪茄煙葉的含水率。

1.3.3? 有機酸代謝關鍵酶活性? 蘋果酸脫氫酶（MDH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、檸檬酸合酶（CS）活性分別按照相應酶試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司生產）方法測定。

1.3.4? 非揮發性有機酸含量測定方法? 采用YC/T 288—2009《煙草及煙草制品多元酸的氣相色譜法》測定蘋果酸、檸檬酸、丙二酸和草酸含量[11]。

1.3.5? 化學成分含量測定方法? 煙葉化學成分含量采用流動分析法測定[12]。

1.4? 數據分析

采用Microsoft Excel 2010進行數據整理及作圖，運用SPSS 21.0進行數據分析。

2? 結? 果

2.1? 晾制密度對晾房溫濕度及煙葉含水率的影響

由表1可知，隨著晾制的進行，晾房內溫度逐漸升高，而濕度則呈先上升后下降變化，在晾制5 d達到峰值;在相同時間內，隨著晾制密度的增加，晾房內溫濕度均增加。在晾房內溫濕度影響下，不同處理雪茄煙葉含水率均呈下降趨勢，處理間比較，煙葉含水率表現為M1>M2>M3。在晾制0～5 d，晾房濕度逐漸增加，此時煙葉含水率降幅較小，之后晾房濕度逐漸下降，在10～15 d下降較快，導致煙葉含水率迅速降低。因此在整個晾制過程中，煙葉失水速率呈現“慢-快-慢”的變化。

2.2? 晾制密度對雪茄煙葉有機酸代謝相關酶活性的影響

MDH、SDH和CS是植物體內三羧酸循環的關鍵限速酶，對植物有機酸代謝起著重要作用。由圖1A所示，不同處理雪茄煙葉MDH活性均呈先上升后下降的趨勢，在晾制15 d達到峰值，此時M1、M2和M3處理酶活性分別為23 188.72、26 945.99和20 312.68 nmol/（min·g）。不同晾制時間MDH活性均表現為M2>M1>M3，并且晾制5～15 d內M2處理與M1和M3差異顯著。隨晾制時間的增加，各處理煙葉SDH活性均逐漸降低（圖1B）。晾制初期SDH活性最高，但處理間差異不顯著。在晾制5 d活性急劇下降，M1-M3處理降幅分別為47.39%、31.06%、57.31%，此時各處理間達到顯著差異;晾制10～20 d，SDH活性趨于平緩，均以M2處理最高，與M1差異顯著。圖1C顯示，晾制過程中各處理煙葉CS活性均呈上升趨勢，在晾制20 d達到最高，此時M1、M2、M3處理相比于晾制開始時分別提高了1.34倍、1.97倍和1.07倍。在晾制0 d，各處理間差異不顯著;在晾制5～20 d，處理間CS活性均表現為M2>M1>M3，M2與M3達顯著水平。

2.3? 晾制密度對雪茄煙葉非揮發性有機酸含量的影響

晾制期間不同處理雪茄煙葉蘋果酸含量均呈下降趨勢（圖2A），M1-M3處理最大降幅分別為56.02%、58.16%和45.42%。晾制期間蘋果酸含量均表現為M3>M1>M2，除晾制初期各處理間無顯著差異外，M2處理均顯著低于M3。由圖2B可知，晾制過程中各處理檸檬酸含量均呈上升趨勢。晾制0 d，各處理檸檬酸含量差異不顯著，隨晾制的進行，檸檬酸含量表現為M2>M1>M3，且除晾制15 d外，各處理均達到顯著差異，晾制20 d相較于0 d分別升高了1.79（M1）、2.68（M2）、1.63（M3）倍。與其他有機酸相比，煙葉內丙二酸含量較低（圖2C），各處理丙二酸含量均呈逐漸上升趨勢，晾制20 d與晾制初期相比，M1-M3處理分別升高了85.36%、83.77%、71.65%。整個晾制期間，丙二酸含量均以M3最高，其次為M1、M2處理;除晾制0 d外，M2與M3處理差異顯著。圖2D顯示，晾制期間各處理雪茄煙葉草酸含量均呈上升趨勢，但變化幅度較小。各時期草酸含量均表現為M2>M3>M1，但處理間差異不顯著。由此可知，整個晾制過程煙葉內草酸含量變化不明顯，且晾制密度對其影響較小。

2.4? 晾制過程中非揮發性有機酸與酶活性的相關分析

如表2所示，各處理蘋果酸含量與MDH活性均呈顯著負相關，與SDH活性均呈極顯著正相關，與CS活性呈顯著或極顯著負相關，其中在M1、M2處理達極顯著水平。檸檬酸含量與MDH活性均呈正相關，但相關性不顯著，與SDH活性均呈極顯著負相關，與CS活性均呈極顯著正相關。丙二酸含量與MDH活性均呈正相關，但只有M1處理達顯著水平，與SDH活性均呈極顯著負相關，與CS活性均呈正相關，但只有M2處理達顯著水平。草酸含量與MDH活性關系不明顯，與SDH活性均呈負相關，但只有M2處理達顯著水平，與CS活性均呈正相關，但只有M1處理達顯著水平。

2.5? 晾制密度對雪茄煙葉化學成分的影響

由表3可知，M2處理煙葉的總糖、還原糖含量以及兩糖比最高，而淀粉含量顯著低于M1、M3處理，表明適當的晾制密度能促進淀粉向可溶性糖的轉化。蛋白質含量變化范圍為4.88%～5.28%，M2處理顯著低于M1和M3。其他化學成分處理間則無顯著差異。鉀氯比作為煙葉燃燒性能的重要指標，在本試驗中以M2處理最高。氮堿比作為評價煙葉內在質量的重要依據，數值越接近1煙葉質量越好[13]。表3中，氮堿比以M2處理最接近1，其次是M1、M3處理。綜合來看，各化學成分以M2處理更為協調。

3? 討? 論

晾制密度可通過調節煙葉間隙，直接影響晾房內的溫濕度以及空氣流速，進而影響煙葉水分的散失程度，而煙葉水分含量與其內部酶活性及大分子物質的轉化密切相關[7，14]。與烤煙相比，雪茄煙葉的晾制條件溫和，晾房內環境對煙葉質量形成具有重要影響。本試驗結果表明，隨晾制密度的加大，晾房溫濕度升高，煙葉含水率也增高，這是由于晾制密度大，煙葉間隔小，葉間隙空氣流速較慢，溫濕度無法及時排除[15]。密度較小時，葉間隙空氣流速增加，煙葉水分散失較快，溫濕度逐漸下降[7]。因此選擇合適的晾制密度對改善晾房內部環境，提高煙葉質量有重要意義。

植物有機酸積累與轉化強度與其相關酶活性密切相關[8]。本研究中，隨晾制的進行，不同處理煙葉MDH活性均呈單峰變化，晾制15 d達到最高，這是由于晾制期間蘋果酸含量呈下降趨勢，在一定程度上促進了MDH的活性[16]，晾制后期煙葉失水萎蔫，導致MDH活性急劇降低。而整個晾制時期CS活性持續升高，這是由于晾制期間煙葉內大部分有機酸的減少使pH向堿性方向變化，誘發了CS活性升高[17]，進而促進了檸檬酸的合成，這與宮長榮等[18]在白肋煙上的研究結果相似。SDH是三羧酸循環和有氧呼吸的功能性成分，它串聯線粒體基質內琥珀酸到延胡索酸的氧化[19]。宋朝鵬等[1]研究表明，烤煙在烘烤過程中SDH活性逐漸降低。本研究發現，晾制期間雪茄煙葉SDH活性呈下降趨勢，這可能由于晾制過程中丙二酸含量升高，有效抑制了SDH的活性[20]。本試驗中，高晾制密度和低晾制密度處理均使有機酸代謝關鍵酶活性處于較低的水平，這是因為高晾制密度的煙葉葉間風速小，溫濕度無法排出，造成高溫高濕的環境[7]，而低晾制密度的煙葉間空氣流速過大，煙葉水分迅速散失，造成水分脅迫，兩種環境均不利于維持較長的生命活動，無法滿足酶所需要的適宜條件[21]，使有機酸代謝強度下降。適宜的晾制密度與其他處理相比，煙葉失水速率適中，氧化還原較平衡，酶活性相對較高，有利于提高煙葉有機酸代謝的能力，保持有機酸的充分轉化，對提高雪茄煙葉吸食品質有重要意義。

有機酸是碳水化合物和含氮化合物的中間產物，間接地調節煙葉中碳氮代謝的進程，進而對煙葉品質產生影響[22]。本研究中，在雪茄煙葉調制過程中，蘋果酸含量逐漸降低，這主要是因為其被用于呼吸消耗，或與金屬離子結合生成鹽[23]。前人研究發現[24]，在蘋果酸代謝中MDH起主導作用，本研究中煙葉蘋果酸含量與MDH呈顯著負相關，M2處理MDH活性最高，促進了蘋果酸向草酰乙酸的轉化，故蘋果酸含量最低。本試驗結果表明，煙葉中檸檬酸含量呈上升趨勢，這可能是因為晾制期間煙葉CS活性逐漸增加，促進了草酰乙酸向檸檬酸轉化，導致檸檬酸含量升高[23]。而M2處理檸檬酸含量最高，這是由于高晾制密度下環境溫濕度較高，煙葉呼吸作用較強，加速了檸檬酸的消耗[25];而低晾制密度的煙葉水分迅速散失，煙葉體內生命活動較慢，不利于檸檬酸的轉化和形成。趙高坤等[26]研究表明，K326在調制過程中丙二酸和草酸含量均逐漸增加。本試驗結果表明雪茄煙具有相似的變化規律，在晾制期間丙二酸和草酸含量均呈上升趨勢，這可能由于丙二酸和草酸屬于低級脂肪酸，而在晾制過程中高級脂肪酸可通過酶促反應向低級脂肪酸轉化[27]。相關性分析可知，丙二酸與SDH間呈極顯著負相關，這說明了丙二酸可作為SDH的競爭性抑制劑，有效抑制SDH的活性，故晾制過程中丙二酸含量以M2處理最低。而處理間草酸含量無顯著差異，表明了晾制密度對草酸影響較小。

4? 結? 論

綜合來看，不同晾制密度對雪茄煙葉非揮發性有機酸含量、相關酶活性及各種化學成分都有顯著 影響，在竿距25 cm的晾制密度下，煙葉內MDH、CS和SDH活性最高，檸檬酸和草酸含量較高，蘋果酸與丙二酸含量較低，有助于保證晾制時期有機酸轉化的順利進行，且整體化學成分協調，提高了調制后煙葉質量。因此，雪茄煙葉在晾制過程中，將晾制密度控制在竿距25 cm能提高煙葉非揮發性有機酸代謝能力，促進煙葉內在物質轉化，改善煙葉的內在品質。本研究可為優化雪茄煙葉晾制技術提供理論依據。

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