PYCR1在胃癌細胞中的表達及生物學功能研究

孫娟　林暉　王耀新　蔡惠美　唐晶晶

【摘要】 目的：研究與分析PYCR1在胃癌細胞中的表達及生物學功能。方法：選取2017年10月-

2020年1月本院32例胃癌患者為觀察組，同時期的32例胃炎患者為對照組。比較兩組的病灶組織PYCR1表達情況，并比較觀察組中不同疾病分期及淋巴結轉移情況者的PYCR1表達情況，采用Spearman秩相關分析其與疾病分期及淋巴結轉移情況的關系;取胃癌AGS、SGC-790及MGC-803細胞分別分為si-NC組（轉染對照質粒）與si-PYCR1組（轉染敲低序列PYCR1質粒），比較各組的細胞克隆數、凋亡細胞率及細胞穿膜數。結果：觀察組的PYCR1表達水平高于對照組（P<0.05）。觀察組中不同疾病分期及淋巴結轉移情況者的PYCR1表達水平比較，差異均有統計學意義（P<0.05），Spearman秩相關分析顯示，PYCR1與疾病分期及淋巴結轉移情況均呈正相關（rs=0.910、0.881，P<0.05）。AGS、SGC-790及MGC-803細胞的si-PYCR1組的細胞克隆數及細胞穿膜數均低于si-NC組，凋亡細胞率均高于si-NC組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：PYCR1在胃癌細胞中呈現高表達，且與疾病分期及淋巴結轉移情況均呈正相關，干擾PYCR1可有效控制胃癌細胞增殖及遷移侵襲。

【關鍵詞】 PYCR1 胃癌細胞 增殖 遷移 侵襲

Study on the Expression of PYCR1 in Gastric Cancer Cells and Biological Function/SUN Juan， LIN Hui， WANG Yaoxin， CAI Huimei， TANG Jingjing. //Medical Innovation of China， 2021， 18（23）： -166

[Abstract] Objective： To study and analyze the expression and biological function of PYCR1 in gastric cancer cells. Method： From October 2017 to January 2020， 32 patients with gastric cancer in our hospital were selected as the observation group， and 32 patients with gastritis during the same period were selected as the control group. The expression of PYCR1 in the two groups was compared， and the expressions of PYCR1 in patients with different disease stages and lymph node metastasis in the observation group were compared. The relationship between PYCR1 and disease stage and lymph node metastasis was analyzed by Spearman rank correlation. Gastric cancer AGS， SGC-790 and MGC-803 cells were divided into si-NC group （transfected control plasmid） and si-PYCR1 group （transfected knockdown sequence PYCR1 plasmid）， respectively. The number of cell clones， apoptotic cell rate and cell transmembrane number were compared in each group. Result： The expression level of PYCR1 in the observation group was higher than that in the control group （P<0.05）. The differences of PYCR1 expression levels in patients with different disease stages and lymph node metastasis in the observation group were statistically significant （P<0.05）. Spearman rank correlation analysis showed that， PYCR1 was positively correlated with disease stage and lymph node metastasis （rs=0.910， 0.881， P<0.05）. The number of cell clones and cell transmembrane number in si-PYCR1 group of AGS， SGC-790 and MGC-803 cells were lower than those in si-NC group， and the rates of apoptotic cells were higher than those in si-NC group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： PYCR1 is highly expressed in gastric cancer cells and is positively correlated with disease stage and lymph node metastasis， interfering with PYCR1 can effectively control the proliferation， migration and invasion of gastric cancer cells.

[Key words] PYCR1 Gastric cancer cells Proliferation Migration Invasion

First-author’s address： Fuzhou First Hospital， Fuzhou 350009， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.23.040

胃癌是消化系統常見惡性腫瘤，與胃癌相關的各方面研究一直是臨床重點。與胃癌預后相關的研究中，胃癌細胞的增殖侵襲及轉移能力是重要因素[1-2]。PYCR1作為在多類惡性腫瘤患者中研究較多的指標，較多研究認為其對于腫瘤細胞的增殖及侵襲轉移具有促進作用[3-5]。臨床中關于PYCR1在胃癌細胞中的作用機制，尤其是生物學功能的研究極為匱乏，且在細致程度方面有所欠缺，因此本方面的研究意義較高。本研究就PYCR1在胃癌細胞中的表達及生物學功能進行研究與分析，以為疾病的診治與控制提供參考依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）組織標本來源。選取本院2017年10月-2020年1月收治的32例胃癌患者為觀察組，另選取同時期32例胃炎患者為對照組。納入標準：20～75歲者;男女不限;觀察組為確診為胃癌者，對照組為確診為胃炎者。排除標準：合并其他消化系統疾病者;合并創傷者;妊娠期及哺乳期者;合并慢性基礎疾病者;合并代謝性疾病者。患者均對研究知情同意。（2）胃癌細胞。胃癌AGS、SGC-790及MGC-803細胞均來源于中國科學院。（3）試劑。基礎培養基和胎牛血清（Biological Industries，美國），酶標儀（Invitrogen公司，美國），CCK-8細胞計數檢測試劑盒（CST，美國），兔抗人-PYCR1抗體、HRP抗兔二抗（北京博奧森生物公司），Transwell小室（Corning公司），Trizol試劑（Ta Ka Ra公司），CCK8試劑（同仁公司），Matrigel基質膠（BD公司）。本研究已經倫理學委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 對照組和觀察組PYCR1表達情況 采集兩組病灶組織標本，將組織標本進行常規處理，采用RT-qPCR法進行其相對表達量的檢測，首先進行總RNA的提取，然后進行2-ΔΔCt的方法進行相對表達量的計算，比較兩組的病灶組織PYCR1表達情況，并比較觀察組中不同疾病分期及淋巴結轉移情況者的PYCR1表達情況，采用Spearman秩相關分析其與疾病分期及淋巴結轉移情況的關系。

1.2.2 胃癌細胞分組與培養 將胃癌AGS、SGC-790及MGC-803細胞株置于添加青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL的含15%胎牛血清DMEM培養液中培養。選取對數生長期細胞胰酶消化后，用基礎培養基調整細胞密度為1×106個/mL，

將細胞接種到6孔板后37 ℃孵育24 h。按照制造商說明書用Lipofectamine TM 2000將三種胃癌細胞分別轉染三種敲減序列PYCR1質粒（5’-TGAGAAGAAGCTGTCAGCGTT-3’;5’-TCAGAGCTGAAAGTGGACGT-3’;5’-TAGAACCTATGAAGGAAGGTT-3’），利用RT-qPCR和免疫印跡試驗檢測PYCR1表達，選取干擾效率最高的細胞株進行后續試驗，命名為si-PYCR1組;另取三種胃癌細胞轉染對照質粒siRNA-NC作為si-NC組。

1.2.3 克隆形成實驗 轉染48 h后取AGS、SGC-790及MGC-803細胞si-NC組與si-PYCR1組的對數生長周期的細胞，以胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，將其懸浮于10%胎牛血清的培養液中，細胞懸液進行梯度倍數稀釋，以梯度密度接種于37 ℃培養皿中，與5% CO2下培養2～3周，形成肉眼可見的克隆后，采用PBS浸洗，處理2次，采用多聚甲醛進行固定，染色，流水洗去染色，進行干燥處理后采用制成透明膠片，低倍鏡下進行克隆數的計數。實驗重復5次。

1.2.4 AnnexinV/PI雙染色細胞凋亡試驗 收集各組細胞，調整待檢測細胞濃度，預冷PBS進行兩次潤洗，4 ℃條件下3 000 r/min，離心5 min，將細胞重懸與Binding Buffer，加入Annexin-FITC并混勻，避光條件下置于冰上，15 min后將其轉至流式檢測管，加入PBS，再加入PI后上機檢測，另以不加Annexin-FITC及PI的作為陰性對照。分別加Annexin-FITC及PI作為橫軸與縱軸進行結果分析，統計分析凋亡細胞率。實驗重復5次。

1.2.5 Transwell細胞侵襲實驗 將基質膠提前放置在4 ℃冰箱內融化，以1︰8 的比例將其與不含血清的Matrigel基質膠混勻，將混合液每個小室加入100 μL后放入37 ℃孵箱內24 h。各組細胞消化離心，使用無血清的Matrigel基質膠重懸細胞計數，調整細胞密度為3×108個/L。將Transwell小室置入24孔板內，在小室上室加入200 μL細胞懸液，下室加入700 μL含血清的完全培養基。細胞孵箱內正常培養24 h后取出小室，PBS輕輕洗滌后，用棉簽擦去小室內側細胞。4%多聚甲醛固定20 min后晾干，再用0.1%結晶紫染色15 min 后，PBS清洗小室2～3次后自然風干，最后顯微鏡觀察穿膜細胞并拍照，保存后使用軟件計數。實驗重復5次。

1.3 統計學處理 采用SPSS 23.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，重復測量的計量資料進行方差分析;計數資料以率（%）表示，比較采用χ檢驗;因素之間的關系采用Spearman秩相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 對照組男20例，女12例;年齡29～75歲，平均（65.3±6.9）歲，其中淺表性胃炎2例，糜爛性胃炎10例。觀察組男19例，女13例;年齡30～76歲，平均（65.7±7.0）歲;疾病分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期10例，Ⅳ期6例;淋巴結轉移情況：無轉移12例，近處轉移11例，遠處轉移9例。兩組年齡與性別比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組PYCR1表達情況比較 觀察組的PYCR1表達量為（3.63±0.56）高于對照組（1.21±0.21），差異有統計學意義（t=22.889，P=0.000）。

2.3 觀察組中不同疾病分期及淋巴結轉移者的PYCR1表達情況比較 觀察組中不同疾病分期及淋巴結轉移情況者的PYCR1表達比較，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。Spearman秩相關分析顯示，PYCR1與疾病分期及淋巴結轉移情況呈正相關（rs=0.910、0.881，P<0.05）。

2.4 胃癌AGS、SGC-790及MGC-803細胞經不同轉染后細胞克隆數、凋亡細胞率、細胞穿膜數比

較 AGS、SGC-790及MGC-803細胞si-PYCR1組的細胞克隆數及細胞穿膜數均低于si-NC組，凋亡細胞率高于si-NC組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

3 討論

胃癌是臨床研究的重點，與之相關臨床研究較多，且涉及面較廣，其中與腫瘤細胞增殖、侵襲轉移等方面的研究是重中之重。臨床中與腫瘤細胞相關信號通路及增殖、凋亡調控相關的基因研究涉及種類較多[6-9]。PYCR1在前列腺癌、乳腺癌等多類惡性腫瘤中的研究可見，其主要為通過影響脯氨酸代謝來達到影響腫瘤細胞增殖的目的，在多類惡性腫瘤細胞中都呈現出相對較高的表達狀態[10-14]。近年來關于PYCR1在惡性腫瘤中的表達研究不斷增多，其中可見在結腸癌等消化系統惡性腫瘤的表達變化研究，但是其在胃癌患者中的表達仍有待探究[15-18]。

本研究結果顯示，觀察組的PYCR1表達水平高于對照組（P<0.05）;觀察組中不同疾病分期及淋巴結轉移情況者的PYCR1表達水平比較，差異均有統計學意義（P<0.05）;Spearman秩相關分析顯示，PYCR1與疾病分期及淋巴結轉移情況均呈正相關（rs=0.910、0.881，P<0.05），肯定了PYCR1在胃癌患者中的檢測價值及其與胃癌疾病分期、淋巴結轉移的相關性。AGS、SGC-790及MGC-803細胞的si-PYCR1組細胞克隆數及細胞穿膜數均低于si-NC組，凋亡細胞率均高于si-NC組（P<0.0.5），進一步肯定了PYCR1表達對于胃癌腫瘤細胞的增殖、侵襲等方面的影響。PYCR1在脯氨酸代謝過程中，極大地影響到氧自由基的代謝，進而通過影響鈣調磷酸激酶途徑來達到影響腫瘤細胞增殖的目的[17-20]。

綜上所述，PYCR1在胃癌細胞中呈現高表達，且與疾病分期及淋巴結轉移情況均呈正相關，干擾PYCR1可有效控制其增殖及遷移侵襲。

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（收稿日期：2020-09-30） （本文編輯：田婧）