細胞學p16INK4a檢測在宮頸癌初篩與早期診斷中的意義

陳春麗，沈 力，沈夢露，王婷婷，鄧鑫州*

[1.湖北省十堰市太和醫院(湖北醫藥學院附屬醫院) 腫瘤科，湖北 十堰442000；2.湖北醫藥學院基礎醫學院 生物化學教研室，湖北 十堰442000]

宮頸癌是導致中青年女性癌癥患者死亡重要原因[1]。p16INK4a與宮頸上皮內瘤變(CIN)和宮頸癌的發生發展具有緊密的聯系，p16INK4a蛋白的表達水平能夠有效反映機體感染HR-HPV后對DNA整合狀態、致瘤風險的大小以及癌基因的表達活性[2-4]。因此，作為新一代的子宮頸細胞學檢查方法，p16INK4a免疫細胞化學染色技術有潛力成為優選女性宮頸癌篩查方法，為早期宮頸癌診斷提供重要幫助。本研究通過比較p16INK4a免疫細胞化學染色、宮頸薄層液基細胞學檢查(TCT)及高危人乳頭瘤病毒(HR-HPV)檢測對宮頸癌篩查的結果，旨在評價p16INK4a染色作為人群宮頸病變初篩及早期診斷宮頸癌的可行性及有效性。

1 資料與方法

1.1 研究對象于2019年2月至2019年12月招募湖北十堰地區1927例女性作為研究對象。納入標準：①年齡在25-50歲，有性生活史；②既往無宮頸病變或宮頸癌病史；③既往未行子宮放療或宮頸切除手術。排除標準：①合并生殖內分泌系統疾病；②全身基礎條件差，合并其他系統的嚴重疾病。所有受檢者均簽署知情同意書，并接受宮頸HR-HPV檢測、TCT、p16INK4a檢查。本項目經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1宮頸細胞學檢查 采集樣本利用AutoCyte制片機(TriPathImaging公司，美國)制成宮頸脫落細胞液基薄片，經染色后封片。閱片標準為2001版Bethesda陰道或宮頸細胞學診斷的系統[5]。當結果TCT高于低級別鱗狀上皮內病變(LSIL)/不典型腺細胞(AGC)為陽性。

1.2.2高危HPV檢測 采用CobasX480核酸自動提取儀和CobasZ480擴增分析儀(Roche公司，美國)進行檢測，通過全自動樣品制備與即時PCR擴增技術得到HPV16型、18型、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68的混合結果。

1.2.3p16INK4a免疫細胞染色 利用p16INK4a蛋白單克隆鼠抗人抗體(森盈生物科技有限公司，深圳)進行多聚螯合物酶法染色。在光學顯微鏡下可見p16INK4a位于細胞核及細胞質內，呈深棕色和棕黃色。發現p16INK4a著色的細胞≥1個即為陽性。染色結果見圖1。

圖1 p16INK4a陰性(左)，p16INK4a陽性(右)，×100倍

1.2.4陰道鏡活檢病理診斷 初篩時任一項目結果陽性即需接受陰道鏡下宮頸管搔刮加四象限定點加隨機活檢(POI)方案活檢。診斷標準參照2017版中國宮頸癌篩查及異常管理相關問題專家共識[6]。

1.3 統計學方法應用SPSS25軟件處理數據。率的比較采用卡方檢驗、Fisher確切概率法。不同方法識別CIN的靈敏度、特異度的差異比較采用McNemar檢驗。閱片醫師判讀p16INK4a和TCT檢測結果的一致性通過計算Kappa值進行比較，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 總體篩查結果完成篩查人群共計1927例，任一篩查項目為陽性者比率為13.91%(268/1927)，其中p16INK4a陽性率7.06%(136/1927)，TCT陽性率為4.77%(92/1927)，HR-HPV陽性率8.46%(163/1927)。首篩陽性人群中回叫應答率為83.21%(223/268)，均接受陰道鏡檢查，病理診斷結果176例為非CIN(單純HPV感染或慢性宮頸炎)，27例為CIN1期病變，11例為CIN2期病變，9例為CIN3期病變。

2.2 不同級別宮頸病變不同檢測方法的陽性率比較根據病例診斷結果將首篩陽性的患者分為非CIN組、低級別病變組(CIN1期)和高級別病變組(CIN2期、3期)。在非CIN組中p16INK4a陽性率高于TCT陽性率(χ2=5.142，P=0.029)，低于HR-HPV的陽性率(χ2=6.372，P=0.016)；在低級別病變組中p16INK4a的陽性率與TCT和HR-HPV檢測相近，差異無統計學意義(P>0.05)，而在高級別病變組，p16INK4a陽性率也與TCT和HR-HPV檢測相近，差異無統計學意義(P>0.05)。此外，以非CIN組、低級別病變組和高級別病變組為序，p16INK4a的陽性率明顯提高，隨著CIN病變級別的提高呈現出趨勢性增加(χ2=9.074，P=0.002)，詳見表1。

表1 不同篩查方法陽性率的比較[n(%)]

2.3 p16INK4a與TCT閱片結果一致性比較共有1595例p16INK4a、1768例TCT標本由兩位閱片經驗豐富的高年資病理學醫師進行獨立盲法閱片。對p16INK4a結果判讀的陰性一致率、陽性一致率和整體一致性均明顯高于TCT(P<0.001)，其中對TCT閱片結果的Kappa值為0.573，而對p16INK4a閱片結果的Kappa值為0.944，詳見表2。

2.4 p16INK4a、TCT以及HPV檢查在宮頸癌篩查中的效能比較在排除45例首篩陽性但未接受陰道鏡檢查明確診斷的患者，最終納入1882例受檢者進行篩查效能分析。p16INK4a、TCT及HR-HPV檢測篩出CIN病變的的靈敏度分別為82.98%(39/57)、74.47%(35/57)和87.23%(41/57)，特異度依次為85.78%(1574/1835)、74.93%(1365/1835)和86.76%(1592/1835)。其中靈敏度p16INK4a與HR-HPV均明顯大于TCT(P<0.05)，但二者間無明顯差異(P>0.05)，而特異度p16INK4a與TCT明顯大于HR-HPV(P<0.05)，但二者間無明顯差異(P>0.05)。

表2 p16INK4a與TCT檢查結果判讀一致性比較(%)

3 討論

TCT與HR-HPV檢測是目前宮頸癌篩查的主要方法,其中HR-HPV檢測應用最為廣泛，具有較高的敏感性，但是特異度低，可能會產生過度干預或者不必要的陰道鏡轉診，提高了醫療成本，并有可能引起受檢者的焦慮緊張情緒[7]；而TCT檢查的敏感度相對較低，由于判讀具有主觀性，結果容易因閱片醫師的不同而產生差異，可能會導致誤診漏診，對技術人才的依賴性也較高，在資源匱乏的地區難以實現大范圍的篩查工作[8]。因此，臨床上亟待改進宮頸癌的篩查方法，通過探尋更精確有效而又客觀易行的生物學標志物來對宮頸癌的篩查方案進行優化十分必要。

p16INK4a能夠判斷機體是否因HPV感染而影響宮頸細胞周期調控[9]。與傳統宮頸癌篩查方法相比，通過對子宮頸脫落細胞進行p16INK4a免疫細胞染色，能夠根據細胞著色結果進行判讀，而不僅僅依靠細胞的形態，因此最大限度地降低了主觀因素帶來的偏倚[10]。因此p16INK4a檢查經過短期的系統培訓即可閱片，對病理醫師診斷經驗的要求較低。另一方面，雖然HR-HPV檢測能夠篩查出宮頸病變的患者，但目前尚無足夠的證據表明其能反映病變的程度[11]。而Wu等[12]則發現，p16INK4a染色能夠有效地鑒別低級別與高級別的CIN。在本次研究中，隨著宮頸病變程度的加重，p16INK4a的陽性率明顯呈現出上升趨勢。p16INK4a染色能夠對HR-HPV持續感染的細胞進行定位，進一步對陽性細胞的形態進行觀察判斷，能夠很大程度地增強甄別不典型細胞的能力，從而提高篩查的準確率。在非CIN組中p16INK4a陽性率低于HR-HPV的陽性率，但高于TCT陽性的比率，而在低級別和高級別病變組中p16INK4a的陽性率與TCT和HR-HPV檢測相近，同樣能夠準確發現可能發生的病變風險。

為了驗證本研究中免疫細胞染色p16INK4a作為篩查宮頸癌的生物學標志物的穩定性，本次研究對兩名經驗豐富的高年資閱片醫師的結果進行了分析，結果顯示二者的p16INK4a判讀結果無論是陰性還是陽性的樣本判讀的一致性都很高，明顯大于對TCT判讀的陽性一致率，進一步證明了p16INK4a染色結果判讀具有客觀性和可重復性，受閱片醫師的影響很小。在既往報道中，有學者也通過兩名醫師對宮頸癌篩查細胞學Ki-67/p16雙染結果進行判讀，其陽性、陰性、整體一致性的Kappa值分別為0.641、0.629以及0.612[13]。而另一項研究中，通過7名醫師對HPV陽性女性的細胞樣本Ki-67/p16雙染結果進行判讀，整體一致性的Kappa值為0.74[14]。

本研究還對p16INK4a篩查識別高級別宮頸病變的特異度及靈敏度進行了分析，分別為95.3%和90.0%，與TCT靈敏度和HR-HPV檢測陽性的特異度均無明顯差異。近來歐洲一項大型橫斷面臨床研究中，通過招募27349名女性進行HPV檢測、巴氏細胞學檢查和p16INK4a/Ki-67雙染檢測，結果顯示p16INK4a/Ki-67雙染在識別CIN2期病變和CIN3期病變時的特異度為95.2%和94.8%，與巴氏細胞學檢查相當(95.4%和95.1%)，但是p16INK4a的識別靈敏度卻明顯高于巴氏細胞學檢查(86.7% vs 68.5%和87.4% vs 73.6%)[15]，說明p16INK4a能夠更加精準地對人群宮頸病變情況進行篩查，尤其是在細胞學檢查尚不發達的地區，p16INK4a染色可能是TCT的有效替代方案。

綜上所述，本研究認為p16INK4a染色在以人群為基礎的宮頸癌初篩中對宮頸病變識別特異度與TCT相當，敏感度與HR-HPV檢測相當，在宮頸癌的早期識別中具有一定優勢。p16INK4a染色作為新一代宮頸細胞檢查技術，其結果易判讀，可重復，客觀性強，兼具高特異度與高敏感性，有潛力成為大范圍人群普篩與精確轉診的優選技術。并且，p16INK4a染色簡捷快速、成本較低，符合我國國情，適合在廣大基層醫療機構中實施，但由于本研究僅為橫斷面研究，具有一定局限性，將來需納入更大樣本量進行長期的前瞻性研究，從而進一步評估p16INK4a染色對于宮頸病變轉歸及預后的預測作用。