熊果酸對喉癌Hep-2細胞bcl-2、Bax基因表達和凋亡影響

周曉紅，盧曉麗，楊 雪，連 蕾，馮志星

(河北省邯鄲市中心醫院 腺體外科，河北 邯鄲056001)

喉癌是一種臨床上常見的頭頸部癌癥，其早期癥狀不明顯或無特異性，多數患者被確診時已處于中晚期階段，且近年來隨著環境污染及人們生活飲食的改變，其發病逐年上升[1]。目前，手術結合放化療等綜合治療是喉癌主要的治療方法，但中晚期患者病情嚴重，其療效一般且預后往往較差，故如何提高患者的療效具有重要的臨床意義[2]。而熊果酸是是一種五環三萜類化合物，對多種腫瘤均有抑制作用，有助于促使癌細胞凋亡[3]。此外，相關研究顯示，B淋巴細胞瘤-2(bcl-2)、凋亡相關因子Bcl-2相關X蛋白(Bax)是細胞凋亡重要的開關分子，其在癌細胞凋亡中具有重要的作用[4-5]。對此，本研究通過在喉鱗狀細胞癌細胞中應用熊果酸進行實驗，探討其對喉鱗狀細胞癌細胞bcl-2、Bax基因表達及凋亡的影響，以明確其對喉癌的抗腫瘤作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 主要材料Hep-2喉鱗狀細胞癌細胞株(南京凱基生物有限公司)，新生胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM培養基(中國上海GIBICO公司)，二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(MTT)、熊果酸(美國Sigma公司)，注射用順鉑(山東齊魯制藥有限公司)，bcl-2、Bax基因引物(上海博亞生物公司)，caspase-3蛋白抗體(美國Proteintech公司)，反轉錄試劑盒、RNA提取分離試劑盒、逆轉錄-聚合酶鏈反應法(RT-PCR)熒光定量檢測試劑盒均購自上海吉瑪公司，PBS磷酸鹽緩沖液(北京Solarbio公司)，顯色試劑盒(美國Pierce公司)，其余材料均購自中國上海Hyclone公司；超凈工作臺、Facscalibur流式細胞儀及其配套試劑(美國BD公司)，核酸蛋白測定儀和化學發光凝膠成像儀(美國GE公司)，CO2培養箱(美國Thermo公司)，逆轉錄-聚合酶鏈反應法(RT-PCR)儀(美國Invitrogen公司)，680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)，倒置顯微鏡和共聚焦熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，其余儀器均購自蘇州凈化設備廠。

1.2 方法

1.2.1細胞選取 將復蘇后的Hep-2喉鱗狀細胞癌細胞株置入質量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃、體積分數為5%的CO2、飽和濕度的培養箱中進行培養，選擇生長狀態良好和密度為85%以上時的細胞繼續培養，加1 ml胰酶消化、取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2分組及培養 取Hep-2喉鱗狀細胞癌細胞依據隨機數字表分為A組、B組、C組，每組10個復孔，A組給予常規培養，B組在此基礎給予50.0 μmol/L熊果酸培養，C組給予6 μmol/L順鉑培養；調整細胞濃度至5×104個細胞/ml，并制成細胞懸液接種于96孔板，每孔滴加20 μl的MTT，培養4h后去上清，每孔加入200 μl的DMSO并振蕩10 min，待檢測。

1.2.3RT-PCR檢測 于處理1 h和處理1、3、5 d取Hep-2喉鱗狀細胞癌細胞、加0.25%胰酶消化并離心(1 000 r/min、5 min)后，收集細胞、提取總RNA并反轉錄合成cDNA，設計bcl-2、Bax基因引物序列(見表1)，將1 μl的cDNA置于10 μl反應體系中94℃擴增2 min、膠回收法純化DNA片段后進行RT-PCR反應，以β-actin為內參，以2-△△CT法計算bcl-2、Bax基因相對表達量，并計算其比值bcl-2/Bax[4-5]。

1.2.4Western Blot(WB)檢測 于處理1 h和處理1、3、5 d取Hep-2喉鱗狀細胞癌細胞提取細胞總蛋白、變性、凝膠電泳、轉膜、封閉2 h后，設β-actin對照組，加1∶1000的caspase-3蛋白一抗，4℃雜交12 h、加二抗、洗膜、顯影后，酶標儀掃描分析吸光度后分析灰度值，并計算相對表達量=(caspase-3蛋白灰度值/β-actin灰度值)×100%。

1.2.5細胞增殖實驗(MTT法)檢測 于處理1 h和處理1、3、5 d在96孔板中，每孔加入10 μl的MTT(5 g/L)孵育4 h、加150 μl的DMSO、震蕩10 min，通過酶標儀檢測570 nm波長吸光度(OD值)，測量3次并取平均值。

表1 bcl-2、Bax基因引物序列

2 結果

2.1 兩組bcl-2、Bax基因表達量及bcl-2/Bax比較

A組、B組和C組處理1h bcl-2、Bax基因表達量及bcl-2/Bax比較，差異無統計學意義(P>0.05)，B組和C組處理1、3、5 d的bcl-2基因表達量明顯低于A組，B組和C組處理1、3、5 d的Bax基因表達量、bcl-2/Bax明顯高于A組，差異有統計學意義(P<0.05)，B組和C組處理1、3、5 d的bcl-2基因表達量、Bax基因表達量、bcl-2/Bax比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2、3、4和圖1、2。

表2 兩組bcl-2基因表達量比較(%)

表3 兩組Bax基因表達量比較(%)

表4 兩組bcl-2/Bax比較

圖1 兩組bcl-2基因表達量的RT-PCR檢測

圖2 兩組Bax基因表達量的RT-PCR檢測

2.2 兩組caspase-3蛋白表達量比較

A組、B組和C組處理1h caspase-3蛋白表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)，B組和C組處理1、3、5 d的caspase-3蛋白表達量明顯高于A組，差異有統計學意義(P<0.05)，B組和C組處理1、3、5 d的caspase-3蛋白表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表5和圖3。

2.3 兩組喉癌Hep-2細胞A570值比較

A組、B組和C組處理1 h比較，差異無統計學意義(P>0.05)，B組和C組處理1、3、5d的喉癌Hep-2細胞A570值明顯低于A組，差異有統計學意義(P<0.05)，B組和C組處理1、3、5 d的喉癌Hep-2細胞A570值比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表6。

3 討論

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其發病機制尚未明確，主要與環境、飲食及生活習慣、遺傳等有關，可導致痰中帶血、吞咽困難、聲嘶等癥狀，若未及時治療，其臨床預后差、死亡率高[1-2]。而喉癌主要采取以手術為主、以放療等其他治療為輔的綜合治療，可改善患者的病情，但仍有部分患者因局部復發或轉移而導致療效欠佳，嚴重影響患者的生存預后[5-6]。

表5 兩組caspase-3蛋白表達量比較(%)

圖3 兩組caspase-3蛋白表達量的WB檢測

表6 兩組喉癌Hep-2細胞A570值比較(%)

熊果酸是一種具有多種生物學活性的五環三萜類化合物，且隨著研究的深入，其具有良好的抗氧化、抗炎、降血脂、抗增殖、抗癌、抗誘變等作用，尤其是對腫瘤細胞增殖具有良好抑制的作用[7-8]。有研究顯示，對舌鱗癌細胞Tca-8113給予熊果酸處理，其可通過調節多種細胞凋亡相關蛋白的表達，從而有效抑制舌鱗癌細胞增殖并促進其凋亡[9]。而相關研究表明，細胞凋亡是一種繼發性程序化死亡過程，有多種基因參與調控，其中bcl-2、Bax是啟動凋亡的重要開關基因，bcl-2具有抑制線粒體破裂、多種凋亡蛋白激活及調節細胞內鈣濃度等作用，并可抑制促凋亡蛋白Bax細胞毒性而抑制細胞凋亡[10-11]；Bax是受bcl-2調節的促凋亡蛋白，具有誘導線粒體滲透性改變、激活凋亡蛋白、釋放細胞色素等，在細胞凋亡中具有重要的作用[12-13]。此外，caspase-3是細胞凋亡中主要的效應蛋白，具有破壞細胞外基質蛋白和骨架蛋白、裂解DNA修復相關分子、抑制凋亡蛋白活性等作用，其活化可啟動細胞凋亡進程并進入不可逆階段[14-15]。

本研究結果顯示，B組和C組處理1、3、5 d的bcl-2基因表達量明顯低于A組，B組和C組處理1、3、5 d的Bax基因表達量、bcl-2/Bax、caspase-3蛋白表達量明顯高于A組，B組和C組處理1、3、5 d的bcl-2基因表達量、Bax基因表達量、bcl-2/Bax、caspase-3蛋白表達量比較無統計學差異，表明熊果酸能夠有效下調喉癌Hep-2細胞的bcl-2基因表達及上調其Bax基因、caspase-3蛋白表達。這可能是由于熊果酸對腫瘤細胞增殖具有良好抑制的作用，能夠有效調節多種細胞凋亡相關蛋白的表達，尤其是其可能通過下調bcl-2基因表達及上調Bax基因、caspase-3蛋白表達等細胞凋亡相關基因表達，使bcl-2基因對喉癌Hep-2細胞抑制線粒體破裂、多種凋亡蛋白激活及調節細胞內鈣濃度等作用下降，有助于降低bcl-2基因對喉癌Hep-2細胞凋亡的作用；同時，上調Bax基因表達能夠增強其誘導線粒體滲透性改變、激活凋亡蛋白、釋放細胞色素等作用，上調caspase-3蛋白能夠破壞喉癌Hep-2細胞外基質蛋白、骨架蛋白及裂解其DNA修復相關分子，有助于促使喉癌Hep-2細胞的凋亡。此外，本研究中，B組和C組處理1、3、5 d的喉癌Hep-2細胞A570值明顯低于A組，此結果與Niu JT、馬海濱等[13-14]研究相似，B組和C組處理1、3、5 d的喉癌Hep-2細胞A570值比較無統計學差異，表明熊果酸能夠有效抑制喉癌Hep-2細胞增殖而促使其凋亡。這可能是由于熊果酸能夠有效促使多種細胞凋亡相關蛋白表達而抑制喉癌Hep-2細胞的增殖能力，尤其是能夠有效調節細胞凋亡相關基因中bcl-2、Bax基因的表達平衡狀態，使喉癌Hep-2細胞的凋亡信號增強而促使caspase-3等細胞凋亡相關蛋白表達增加，從而啟動喉癌Hep-2細胞的凋亡進程并進入不可逆階段而促使喉癌Hep-2細胞的凋亡。本研究也有不足之處，如熊果酸如何下調bcl-2基因表達及上調Bax基因、caspase-3蛋白表達仍不清楚，提示仍需大量的研究。

綜上所述，熊果酸可有效抑制喉癌Hep-2細胞的增殖能力而促使其凋亡，其機制可能與下調bcl-2基因表達及上調Bax基因、caspase-3蛋白表達有關，提示其可望成為喉癌臨床治療的新藥物。