熒光PCR熔解曲線法在檢測臨床標本結核分枝桿菌及其耐藥性中的應用

張匯征，李 桓，張 珍，李俊剛，王 靜，廖傳玉，周 剛，陳耀凱，嚴曉峰，羅 明*

(重慶市公共衛生醫療救治中心 1.中心實驗室；2.感染科；3.藥劑科；4.結核科，重慶400036)

結核病(TB)是由結核分枝桿菌(MTB)引起的慢性傳染病。中國是30個結核高負擔國家之一，同時也是耐多藥結核(MDR-TB)高負擔國家之一。2010年第五次中國結核病流行病學抽樣調查的結果顯示,中國現有活動性肺結核患者總數為523萬，其中傳染性肺結核患者總數為134萬。特別值得注意的是，此次調查顯示中國肺結核患者耐多藥率為6.8%，情況十分嚴重[1]。WHO估算2016年中國結核病患病人數約為78萬人，其中MDR-TB患者約5.8萬人[2]。

結核分枝桿菌及其耐藥性的快速檢測是結核病臨床診斷一直以來的熱點和難點。傳統的檢測如涂片鏡檢，其靈敏度較低；細菌的培養(包括固體培養和液體培養)，需要數周時間；而藥敏實驗不僅耗時長，更需要在生物安全實驗室中進行相關操作，在一般的區縣結防機構和醫院中難以推廣，難以滿足臨床的需要[3]。因此，近年來，分子診斷技術因其快速及高靈敏度，被更多的應用于結核的檢測[4]。

重慶市公共衛生醫療救治中心自2016年7月采用熒光PCR熔解曲線法對病人利福平和異煙肼的耐藥性進行檢測。本研究將通過對臨床數據的回顧性分析，評估熒光PCR熔解曲線法在結核病臨床診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取重慶市公共衛生醫療救治中心2016年7月至2018月7月進行過熒光PCR熔解曲線法結核檢測的患者1 048例，其中男性630例，女性418例，年齡8-83歲。樣品包含痰液，腦脊液，膿液，纖支鏡灌洗液，胸水和穿刺液。

1.2 主要試劑與儀器

CFX96實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；MGIT960結核菌快速培養儀(BD)；thermo scientific高速冷凍離心機；Genexpert全自動熒光定量PCR工作站及MTB/RIF檢測試劑盒(Cephid)；利福平耐藥檢測試劑盒和異煙肼耐藥檢測試劑盒，Lab-Aid 820 結核分枝桿菌核酸提取試劑盒和Lab-Aid 824 核酸提取儀購自廈門致善生物。

1.3 方法

1.3.1分離培養 樣品培養前處理按照《分枝桿菌分離培養標準化操作及質量保證手冊》[5]中關于堿處理-中和離心沉淀法的要求進行，并按照BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養操作說明書將前處理后的沉淀物接種于MGIT960培養管。

1.3.2結核菌的藥敏試驗 改良羅氏比例法參照《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質量保證手冊》的要求操作[6]；Genexpert按Cephid公司操作指南進行；熒光PCR熔解曲線法參照試劑盒配套說明書進行，所有樣品用Lab-Aid 820 結核分枝桿菌核酸提取試劑盒和Lab-Aid 824 核酸提取儀處理，提取基因組DNA；取5 μl核酸加入含20 μl PCR反應液的PCR管中，放入CFX96實時熒光定量PCR儀進行擴增和熔解曲線分析。PCR程序如下：UNG處理50℃ 2 min，1個循環；預變性95℃ 10 min，1個循環；Touchdown循環95℃ 15 s，70℃ 20 s(每個循環下降1℃)，13個循環；PCR循環76℃ 25 s，95℃ 15 s，57℃ 20 s，76℃ 25 s，42個循環。熔解分析：95℃ 2 min，40℃ 2 min，45℃-85 ℃(設置在此階段每1 ℃采集FAM和TET通道熒光信號)，1個循環。當樣品的熔解溫度(Tm)與陽性對照的Tm一致(誤差不超過1℃)時判定為野生型；樣本的Tm低于陽性對照2℃或2℃以上時判定為突變型。當利福平或異煙肼任一抗生素檢測體系有兩個通道以上有有效信號時，判定檢測到結核分枝桿菌。金標準為分枝桿菌培養或Genexpert任一檢驗TB陽性判定該標本為TB陽性。

1.3.3統計學方法 用Microsoft Excel軟件進行基礎數據整理，采用SPSS 13．0分析軟件進行統計學分析。

2 結果

2.1 結核分枝桿菌檢測結果

1 048例標本中，MGIT960培養和Genexpert共檢測到619例TB陽性，429例陰性。陽性標本中，培養法檢測到314例，Genexpert檢測到574例，熔解曲線法檢測到318例。三種方法的敏感度分別為MGIT960 50.73%，Genexpert 92.73%，PCR熔解曲線法51.37%。PCR熔解曲線法的特異度為93.24%(400/429)。

2.2 結核分枝桿菌藥敏檢測結果

共有185例標本同時完成了表型藥敏檢測和PCR熔解曲線法檢測。PCR熔解曲線法檢測利福平藥敏的靈敏度為93.2%，特異度為80.2%，符合率為84.3%；檢測異煙肼藥敏的靈敏度為92.6%，特異度為86.3%，符合率為88.6%。見表1。

表1 PCR熔解曲線法與比例法檢測RIF和INH藥敏結果比較

3 討論

結核病的實驗室診斷是發現傳染源的主要途徑和手段，也是制定結核病治療方案的重要依據。長期以來，結核病的實驗室診斷主要還是依靠涂片鏡檢和細菌培養，存在靈敏度低(涂片鏡檢)和操作復雜，耗時長(結核細菌培養)等缺點，而獲得結核藥敏需時更長[4]。利福平和異煙肼是治療結核病的主要一線藥物，同時耐這兩種藥物的結核稱為耐多藥結核(MDR-TB)。MDR-TB治療難度大、治愈率低、病死率高，發現不及時會導致新的耐藥產生和MDR-TB的傳播[2,7]。目前發現基因突變是結核分枝桿菌產生耐藥性的主要機制，如利福平的耐藥主要由rpoB基因突變引起，異煙肼的耐藥相關基因有inhA，katG和ahpC等[8]。

熒光PCR熔解曲線是近年來應用于結核檢測的一種分子檢測方法，具有準確，快速，操作簡單等優點，被用于檢測對利福平，異煙肼，喹諾酮類，乙胺丁醇以及吡嗪酰胺等藥物耐藥的結核病[9-13]。但是目前的研究主要是用分離培養獲得的菌株作為檢測樣品，直接以臨床標本作為檢測樣品的研究還較少[10,14-16]。

本研究選取2016年7月至2018年7月在重慶市公共衛生醫療救治中心檢驗科進行熒光PCR熔解曲線結核檢測的1 048例病例，將其檢測結果分別與培養和Genexpert的結果比較其對結核檢測的靈敏度。結果顯示，熒光PCR熔解曲線法的檢測靈敏度(51.37%)與MGIT960液體培養(50.73%)相近，但低于Genexpert(93.24%)。其原因可能是，第一，熒光PCR熔解曲線法和Genexpert雖然都是基于熒光PCR的檢測方法，但是Genexpert一個檢測用的樣品量較大(1 ml)，而熒光PCR熔解曲線法的上樣量小(5 μl DNA)；第二，熒光PCR熔解曲線法樣品需處理提取核酸，難免會導致樣品量的損失，因此降低了其靈敏度。

與傳統藥敏比較，PCR熔解曲線法檢測利福平和異煙肼耐藥的靈敏度高(>90%)，特異度和符合率較高(>80%)，與之前對痰液的研究結果一致[17]，說明PCR熔解曲線法不僅可以用來檢測痰液也可以用來檢測其他臨床樣品。

總之，通過本研究，熒光PCR熔解曲線法可以直接對臨床樣本快速檢測結核菌及其耐藥性，具有有效、可靠、靈敏度高的特點，能夠及時對臨床制定治療方案提供依據。