eNOS-894G/T基因多態性與佳木斯地區原發性高血壓的相關性研究

趙海峰，鄭欣欣，隋小芳，王鳳玲，華玥祺，沈士焜

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯154002；2.佳木斯大學研究生部；3.佳木斯大學附屬第一醫院 健康管理體檢中心；4.佳木斯大學附屬第一醫院 老年病科)

原發性高血壓(EH)在中國的發病率呈逐年遞增趨勢[1-2]。內皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因第七外顯子G894T發生基因突變可使其合成的eNOS結構發生改變，影響其功能，導致一氧化氮(NO)合成減低[3]，進而影響血壓[4]。但該基因突變與EH相關性在不同人群中結果存在爭議[5]。因此本研究通過對佳木斯地區老年人群進行eNOS-894G/T基因多態性與EH的相關性研究，報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2015年12月至2016 年 4 月期間在佳木斯大學附屬第一醫院就診及體檢中心體檢的人群為研究對象，選取符合入組標準的受試者共214名，其中EH組114人，包括男性61人、女性53人，平均年齡65.71±10.47歲；健康對照組100人，包括男性52人、女性48人，平均年齡65.60±8.42歲。兩組人群均簽署了知情同意書。

納入及排除標準：EH組入組人群均滿足《中國高血壓基層管理指南(2014年修訂版)》的診斷標準，或既往診斷為EH的患者，經藥物治療血壓控制在正常范圍者亦納入本組；健康對照組人群滿足體檢及化驗無異常，無心腦血管疾病等慢性病病史。排除繼發性高血壓及合并其他系統并發癥者。

1.2 信息采集及DNA制備

對納入的對象進行性別、年齡、既往史及家族史等一般資料的詢問，記錄標準化測量的血壓及各項生化指標。另收集5 ml靜脈血儲存于-20℃冰箱。待所有血樣集齊后，統一使用柱狀法提取100 μl DNA溶液于-20℃冰箱保存。運用Nanodrop ND-1000分光光度計得到其濃度及純度后，進一步稀釋DNA溶液，測量出DNA濃度a，并與蒸餾水配成50 μl溶液，所需DNA溶液量計算方式為：50-1000/a，4 ℃保存備用。

1.3 SNPs的基因分型

1.3.1引物設計 通過NCBI數據庫查詢eNOS 894G/T SNP所在的DNA序列，并使用Premier5.0和Oligo6.0設計引物，上游引物：5’-TTCGACGTGCTGCCCCT-3’；下游引物：5’-GGGCAGAAGGAAGAGTTCT GG-3’，由北京擎科生物有限公司進行引物合成。

1.3.2PCR反應 PCR擴增選用10 μl體系，按要求配置后石蠟油封閉。PCR擴增條件為：95℃預變性5 min；三步循環：95℃變性20 s，51℃復性20 s，72℃延伸5 s，45個循環；然后再72℃延伸30 s，95℃變性30 s，25℃復性2 min，94℃變性30 s，24℃復性4 min。

1.3.3PCR產物的HRM分析 Light Scanner儀專用96孔板中的PCR產物通過2 000 rpm離心5 min后放入儀器中進行數據采集，使用Light ScannerCall IT軟件進行數據分析，本人群中eNOS-G894T多態性被分為GG、GT兩種基因型。

1.4 統計學處理

利用統計學軟件SPSS 20.0進行數據處理。兩組人群基因型和等位基因頻率運用直接計數法進行計算，使用哈迪溫伯格平衡(HWE)檢驗驗證樣本的群體代表性，P>0.05為符合HWE。計數資料均采用例(%)表示，組間比較采用t檢驗，不同基因型間比較采用χ2檢驗。數據有統計學意義需滿足P<0.05。

2 結果

2.1 各組研究對象的一般情況

兩組研究對象的年齡和性別構成無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 各實驗組研究對象年齡和性別構成的比較

2.2 eNOS-894G/T基因多態性的哈迪溫伯格平衡分析

使用HWE檢驗公式對eNOS-894G/T基因多態性在對照組及EH組人群分布情況進行校驗，發現SNP位點分布符合HWE(P>0.05)，表示研究人群可以代表所在群體，見表2。

表2 eNOS-894G/T基因多態性的哈迪溫伯格平衡分析

2.3 兩組的eNOS-894G/T基因型和等位基因頻率分布

對照組及EH組的GG基因型頻率為83%(83例)、70.2%(80例)，GT基因型頻率為17%(17例)、29.8%(34例)，eNOS-G984T基因型頻率在兩組中的分布存在差異，且有統計學意義(P=0.028)。對照組及EH組G等位基因頻率分別為91.5%(183例)、85.1%(194例)，T等位基因頻率分別為8.5%(17例)、14.9%(34例)，eNOS-G984T等位基因頻率在兩組中的分布存在差異，且有統計學意義(P=0.041)，見表3。

表3 兩組的eNOS-894G/T基因型和等位基因頻率分布

3 討論

eNOS 基因由26個外顯子和25個內含子組成，定位于染色體7q35-q36區[6]。Hingorani等首次發現eNOS基因第七外顯子上894位鳥嘌呤到胸腺嘧啶的突變(G894T),導致其289位天冬氨酸取代谷氨酸，eNOS螺旋結構發生改變，從而影響eNOS的活性無法正常催化NO的合成及血壓調節[7-9]。故該基因突變與EH存在一定關聯性。但目前國內外對于eNOS-894G/T多態性與高血壓發病率的研究存在爭議。Lacolley等在高加索人群研究中觀察到eNOS 894G/T位點T等位基因攜帶者EH患病率較G等位基因攜帶者高，未發現等位基因與血壓水平及脈搏波傳導速度相關性，故不能明確該位點突變參與血壓調節[10]。而在日本的一項研究通過注入膽堿后記錄前臂血管流動速度來評估血管舒張功能，結果證實eNOS-894G/T多態性影響內皮依賴的血管舒張功能，但差異未達到統計學意義，且高血壓組及健康對照組中等位基因及基因型分布無差異性[11]。在一項中國薈萃分析中同樣發現第七外顯子第894位T等位基因突變與北方人群高血壓發生存在關聯，而南方人群中無顯著性差異[12]。

本研究采用病例-對照的方法來評價eNOS-894G/T多態性與高血壓的關系，結果發現，其基因型和等位基因頻率在兩組中的分布存在差異，具有統計學意義(P<0.05),證實了eNOS-894G/T突變T等位基因是高血壓危險因素，而劉永生等學者在老年人群的研究中也有相同的結論[13]。但由于基因多態性存在種族差異、不同基因位點變異存在關聯性、研究方法不同以及樣本入組差異等都可能作為混雜因素干擾實驗結果，因此精準可靠的實驗結果仍需在今后大樣本標準化調查研究中或薈萃分析中驗證。