脊髓損傷后肌肉萎縮組織中差異表達基因的生物信息學分析

黃為琰,張文清,鄭詩豪

(1.福建中醫藥大學中西醫結合學院,福建 福州,350122;2.福建省立醫院 神經外科,福建 福州,350001)

脊髓損傷是神經外科一類重癥疾病，可分為創傷性和非創傷性脊髓損傷，前者較為常見，常由外部物理因素引起[1],后者常由腫瘤、缺血或先天性疾病引起[2]。脊髓損傷通過神經元損害、肌肉廢用等途徑引起骨骼肌萎縮[3-4]。目前已有學者對脊髓組織損傷后繼發的線粒體功能障礙、氧化應激激活、肌肉蛋白質合成與降解等過程進行了相關研究[5-6],但其病理、生理的復雜性限制了該病的治療進展。本研究對脊髓損傷后肌肉萎縮患者的肌肉組織進行生物信息學分析，并探討該病的發病機制，以期為潛在治療方法提供理論依據，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 基因芯片的篩選

選擇GEO數據庫中GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺檢測，編號為GSE21497的芯片進行分析。此芯片從招募的10位脊髓損傷肌肉萎縮的患者中獲取骨骼肌樣本，其中包括脊髓損傷患者男9例和女1例(6例為四肢癱瘓,4例為截癱)，平均年齡 44歲。入選標準:18歲以上患者;格拉斯哥昏迷評分大于 13分者;無肌肉擠壓傷、低氧損傷、系統性敗血癥、全身性炎癥者;自身免疫性疾病及惡性腫瘤者。分別在脊髓損傷后第2、5天使用5mm Berstrom活檢針從10位患者的股外側肌獲取肌肉樣本，取下后立即置入液氮中凍存，儲存于-80℃待測。以患者第2天的股外側肌樣本的基因表達譜數據為對照組，以第5天樣本的基因表達譜數據作為實驗組。

1.2 芯片數據處理與差異基因提取

使用R軟件中affyPLM、RColorBrewer包進行芯片數據分析，得出相對對數表達圖，觀察各組樣本數據表達強度。然后調用R軟件中affyPLM、affy包通過RMA算法對芯片進行背景校正。利用R軟件中limma包，設置差異基因篩選條件:logFC>1或logFC<(-1),且adj.P.val<0.05。將提取的差異基因導入OmicShare(https://www.omicshare.com/)在線網站制作出火山圖、熱圖。

1.3 差異基因富集分析

將篩選出的差異基因導入Metascape在線網站，進行GO分析、KEGG信號通路分析，以柱狀圖表現富集結果，獲取基因相關的生物學過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)。

1.4 構建蛋白質互作用網絡

將篩選出的差異基因導入Metascape在線網站，進行蛋白互作網絡構建。利用MCODE算法檢測出相互作用結果緊密的蛋白質模塊中的關鍵差異基因。

2 結 果

2.1 脊髓損傷后肌肉萎縮患者肌肉組織中的差異基因

使用R軟件得出相對對數表達圖，每個樣品的中心均較接近縱坐標0,結果表明樣本平行試驗一致性較強，見圖1A。樣本背景校正后，設置差異倍數大于2及校正后P值小于0.05,篩選出294個差異基因。2組樣本中共有8個上調表達差異基因,286個下調表達差異基因，見表1。將差異基因導入OmicShare在線網站制作熱圖和火山圖，見圖1B、圖1C。

表1 脊髓損傷肌肉萎縮患者第2、5天肌肉樣本的差異基因

2.2 差異基因的GO、KEGG分析

GO富集中,CC中差異基因主要集中于肌纖維組分、肌質、異構SMAD蛋白復合體、肌球蛋白復合物、肌膜、細胞器外膜。分子MF中差異基因主要集中于肌肉的結構組分、肌動蛋白結合、生長因子結合、整聯蛋白結合、碳水化合物結合、β-連環蛋白結合、熱休克蛋白結合、碳酸脫水酶活性、脂肪酸連接酶活性、陰離子跨膜轉運蛋白活性。BP中差異基因主要集中于肌肉器官發育過程、細胞衰亡的正向調控、細胞增殖、分化的負向調控、能量平衡、脂肪細胞分化、細胞對外部刺激的反應、對氮化合物的反應、對酸性化學物質的反應、活性氧代謝過程、輔因子生物合成、突觸修剪等。見圖2。

KEGG信號通路主要包括:補體系統信號通路、FoxO 信號通路、黏著斑信號通路、氮素代謝信號通路、精氨酸和脯氨酸代謝信號通路、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、谷胱甘肽代謝信號通路、鐵死亡信號代謝通路、煙酸和煙酰胺代謝信號通路、半乳糖代謝信號通路等。

2.3 蛋白質相互作用分析及關鍵差異基因獲取

蛋白質互作用網絡中,4個蛋白相互作用較豐富模塊中的關鍵基因共有18個:TNNI1、TNNC1、TCAP、ACTN2、MYL3、MYL2、DNAJA4、DNAJB5、GYS1、UGP2、AKR1B10、GOT1、C1QA、C1QB、C1QC、CASQ2、DAXX、SLC2A4,見圖3。

3 討 論

脊髓損傷導致肌肉萎縮，亦使全身多系統繼發嚴重功能障礙[6]。研究[7-8]表明，在脊髓損傷后6周內，骨骼肌平均橫截面積比對照組低18%～46%,且身體總脂肪率增高。肌肉萎縮可加重胰島素抵抗并促進糖尿病發展[9],同時下肢肌肉收縮力量減弱，引起循環血量不足，導致運動耐力降低、呼吸功能減弱等[10-11]。目前對于該病的研究仍以動物實驗模型為主，本研究選擇GEO數據庫中編號為GSE21497的患者骨骼肌樣本進行研究，更具客觀意義。

通過分析篩選出294個差異基因，經GO分析富集于CC中的差異基因主要存在于肌質、肌膜、肌球蛋白復合物中;MF中差異基因主要參與肌肉構成以及β-連環蛋白、熱休克蛋白等物質的結合過程;BP中差異基因主要參與肌肉發育、突觸修剪、活性氧代謝等過程。研究[5]發現，肌肉蛋白質的合成和降解失衡、氧化應激反應、自噬等過程在該病的進程中起重要作用。CHEN Z等[12]發現，損傷的肌肉組織中FoxM1轉錄因子表達量下降，引起Wnt通路中β-連環蛋白信號過度激活，導致肌肉萎縮和再生不良。通過促進FoxM1轉錄可顯著上調肌肉干細胞中Apc的表達，降低β-連環蛋白水平，拮抗肌肉損傷。CRISTOFANI R等[13]發現，小熱休克蛋白B8分子通過介導錯誤折疊蛋白的自噬可緩解肌肉萎縮。

KEGG信號通路中差異基因主要集中在補體系統、FoxO信號通路、谷胱甘肽代謝等通路。研究[14]發現，肌肉損傷后使用重組趨化因子CCL5可促使補體系統C3a和C3aR信號表達增強，促進肌肉再生。FoxOs通路參與體內眾多重要生物過程，如自噬、ROS解毒、DNA修復等[15-16]。學者[17]發現，抑制FoxO1、FoxO3、FoxO4基因的激活，可緩解自噬、蛋白降解導致的神經性肌肉萎縮。NINFALI C等[18]學者提出,ZEB1可抑制FoxO3轉錄活性，從而抑制肌肉萎縮基因Fbxo32和Trim63啟動子的轉錄。ABDULLAH M等[19]通過建立犬肌肉營養不良模型發現，損傷后組織中膠原蛋白纖維化與肌肉萎縮在相關，而脯氨酸/精氨酸代謝途徑可能是炎癥相關膠原蛋白合成、肌纖維化的核心過程。

通過PPI分析及MCODE算法篩選出18個關鍵差異基因，其中部分基因已被報道與脊髓損傷后肌肉萎縮過程緊密相關。肌鈣蛋白在骨骼肌的收縮過程中起重要作用，脊髓損傷后肌肉組織內源性肌漿網中 Ca2+含量降低約10%，與慢速骨骼肌型肌鈣蛋白I 1 (TNNI1)的表達相關，通過上調骨骼肌中 TNNI1的表達，可增強脊髓損傷者康復運動的抗疲勞性，改善疾病預后[20-22]。肌肉特異性糖原合酶1(GYS1)缺失可導致葡萄糖代謝功能和運動能力受損[23],促進GYS1上調可提高肌肉收縮能力并減緩萎縮。補體級聯反應在神經損傷區域被激活，保護神經免受感染、緩解損害，其具體機制尚未闡明[24-25]。研究[26]證實,C1q、C3、C5等補體在神經損傷后可調控神經再生。此外，肌源性轉錄因子MYOD1可協同E-box調控肌聯蛋白帽(TCAP),促進對骨骼肌新陳代謝[27]。其余關鍵差異基因與肌肉萎縮的研究較匱乏，仍需進一步實驗探索。

目前，治療脊髓損傷后肌肉萎縮的方法包括手術、藥物、基因工程等[28-31]。早期手術減壓可緩解組織繼發性缺氧、缺血，降低細胞損傷程度[32-33]。河豚毒素、苯妥英鈉等鈉通道阻滯劑可維持離子穩態平衡，緩解軸突病變[34-35]。促紅細胞生成素上調SDF-1α與G蛋白偶聯的CXCR4受體等趨化因子的表達，可募集骨髓間充質干細胞，增強組織抗凋亡能力，改善神經功能等[36-37]。甲潑尼龍等激素可上調抗炎因子、降低組織氧化應激反應、減輕水腫等[38]。學者[39-41]提出，激素治療不僅在運動或神經功能恢復上與對照組無明顯差異，還可能會加重感染、胃腸道出血等癥狀。胚胎干細胞移植和多能干細胞誘導可調節炎癥反應，改變微環境，分泌營養因子，使神經再生[42-44]。

綜上所述，本研究所篩選出的差異基因在脊髓損傷病程中涉及微環境變化、神經元變性壞死、肌肉組織纖維化、能量獲取、線粒體功能障礙等重要過程。臨床可對上述基因的相關機制進行深入研究，以為組織損傷后神經肌肉系統的生長、代謝、凋亡等方面的治療提供理論依據，從而改善患者預后。