人冠狀病毒抗體依賴增強作用的研究進展

袁夢嬌，虞 倩，王蓓麗，潘柏申，郭 瑋

（復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032）

冠狀病毒是一種有包膜無節段的單股正鏈RNA病毒，屬于巢病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬，根據其系統發育和基因結構分為4個屬——α、β、γ和δ[1]。2002年、2012年在全球范圍內流行的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome-related coronavirus，SARSr-CoV）和中東呼吸綜合征冠狀病毒（middle east respiratory syndrome-related coronavirus，MERSr-CoV）均可引起嚴重的呼吸系統疾病[2]。2019年年底出現的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）[3]是繼SARSr-CoV、 MERSr-CoV后從野生宿主跨種系感染人類的第3種可引起嚴重呼吸系統疾病的人類冠狀病毒[4]。SARSr-CoV、MERSr-CoV和SARS-CoV-2同屬冠狀病毒β屬[5]。SARS-CoV-2與SARSr-CoV、MERSr-CoV的同源性分別為79.5%、51.8%[5]。目前，針對SARSr-CoV、MERSr-CoV及SARS-CoV-2感染尚無特效治療方案[6]。研制安全、有效的疫苗，開展人群，特別是高危人群免疫接種是較好的防控措施之一。

病毒入侵后，機體會產生特異性中和抗體，抑制病毒感染細胞，但在特定情況下，抗體反而起到促進病毒感染細胞的作用，這一現象被稱為抗體依賴性增強作用（antibodydependent enhancement，ADE）。ADE存在于多種病毒感染過程中，如登革病毒、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、流感病毒、埃博拉病毒等[7-8]，在冠狀病毒感染中也有發現，如SARSr-CoV、MERSr-CoV、貓傳染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus，FIPV）等[9-10]。鑒于抗體在宿主免疫中的重要作用，ADE在疫苗設計、研發等方面的作用引起了學者們的廣泛關注。使用常規疫苗免疫來防治具有ADE作用的病毒常常難以奏效，甚至會誘發疾病進展。ADE是病毒持續性感染、機體免疫失敗及疫苗效果不佳的重要原因，亦是人冠狀病毒至今無有效疫苗的關鍵障礙。本文綜述了人冠狀病毒抗體誘導病毒感染，增強細胞易感性或異常病毒致病的ADE機制，為疫苗設計、抗體相關藥物及免疫治療等提供一定的理論依據。

1 冠狀病毒的ADE現象

ADE最早由HAWKES[11]在20世紀60年代報道，此類研究多見于登革病毒、HIV、埃博拉病毒等[7-8]。冠狀病毒的ADE現象是在1981年被WEISS等[12]報道的。1990年，科學家采用表達FIPV包膜蛋白的重組牛痘病毒免疫貓，產生的特異性抗體增強了FIPV感染巨噬細胞的能力，導致了嚴重的貓傳染性腹膜炎[10]。后續研究證實，用冠狀病毒包膜蛋白可免疫誘導針對動物冠狀病毒的保護性抗體[13]，這種抗體在特定情況下也可增強病毒的感染能力，導致冠狀病毒感染性疾病惡化[14]。

人冠狀病毒包膜主要由3種結構蛋白[核膜（membrane，M）蛋白、包膜（envelope，E）蛋白和棘突（spike，S）蛋白]組成。S蛋白在介導病毒與宿主細胞表面受體結合、觸發病毒包膜與細胞質膜或包涵體膜融合、誘導機體產生中和性抗體及誘導細胞間融合方面起關鍵作用[15]。血管緊張素轉換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是SARS-CoV-2和SARSr-CoV S蛋白的功能性受體，主要參與調節腎素-血管緊張素系統，對急性肺損傷、肺動脈高壓具有保護作用。SARS-CoV-2和SARSr-CoV S蛋白受體結合域與ACE2高效結合，誘導S蛋白構象發生變化，啟動膜融合，介導SARS-CoV-2進入宿主細胞[16]。

YIP等[17]發現針對SARSr-CoV的S蛋白靶抗原的純化IgG抗體促進了SARSr-CoV及S蛋白假病毒慢病毒顆粒（severe acute respiratory syndrome pseudotype particles，SARSr-CoVpp）感染人單核細胞來源的巨噬細胞。LIU等[18]使用重組安卡拉株對照疫苗和表達SARSr-CoV S蛋白的疫苗免疫接種獼猴，用SARSr-CoV鼻腔攻毒后進行取血檢測中和抗體效價、病毒載量，并進行病理學檢查，結果顯示接種疫苗后，S蛋白免疫組血清第2周即產生高滴度的中和性抗體，且持續存在至攻毒后，而對照組的中和抗體在攻毒后才開始升高；而S蛋白免疫組SARS-CoV病毒載量高于對照組（P＜0.05），肺部出現更多促炎的巨噬細胞浸潤和抗炎的巨噬細胞減少，且出現更嚴重的病理性損傷。AGRAWAL等[19]用MERSr-CoV的滅活疫苗免疫小鼠，MERSr-CoV攻擊后，小鼠肺內單核細胞浸潤增加，白細胞介素5、白細胞介素13水平升高，肺部病理性損傷加重。

對SARS-CoV-2感染導致的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的流行病學調查發現，大多數COVID-19患者癥狀較輕，重癥患者多患有基礎疾病，且一部分患者表現為病情進展迅速，出現細胞免疫缺陷、凝血系統活化、心肌損傷、肝臟損傷、腎臟損傷及繼發性細菌感染等。在大多數重癥和死亡的COVID-19患者中，都觀察到淋巴細胞減少和持續的炎癥。而這些癥狀與嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）患者相似[20]。AGRAWAL等[19]認為可能是這些患者曾感染冠狀病毒產生抗體，再次感染SARS-CoV-2后產生ADE，導致病情惡化。CHAN等[21]的研究結果顯示，SARSr-CoV恢復期患者血清可與人冠狀病毒EMC（human coronavirus EMC，hCoVEMC）發生交叉反應，因此他們認為使用SARS患者恢復期血漿治療hCoV-EMC感染時，應考慮低水平中和抗體導致ADE的可能性。

2 冠狀病毒ADE的作用機制

傳統意義的ADE是指當病毒初次感染刺激機體產生針對此類血清型特定的中和抗體，若二次感染不同亞型或變異的病毒，現存的抗體不能中和該類病毒，形成病毒-抗體免疫復合物，與免疫細胞上的IgG Fc受體（Fc receptor，FcR）或補體受體結合進入細胞，從而發生ADE。

LIU等[18]的研究結果顯示，不管是在獼猴還是人類體內，靶向SARSr-CoV S蛋白的IgG抗體均加重了SARSr-CoV攻毒后的機體肺部促炎性巨噬細胞浸潤和病理性損傷，而未免疫S蛋白IgG抗體的機體抗炎性巨噬細胞浸潤增加。這一現象均由FcR介導發生[18]。JAUME等[22]通過監測不同FcR表達模式的免疫細胞系的易感性，證實人FcRⅡ比FcRⅠ和FcRⅢ更易介導SARSr-CoV的ADE。這與黃病毒的ADE類似[23]。用單抗封閉細胞的FcRⅠ或FcRⅢ對Raji B細胞和Daudi細胞的ADE無影響，但封閉FcRⅡ完全消除了這些細胞的ADE[22]。與ACE2受體介導的感染不同的是，FcRⅡ介導的ADE不經過pH值依賴的包涵體或溶酶體途徑，且受半胱氨酸蛋白酶活性的影響較小，即SARSr-CoV可通過抗體介導機制進入常規病毒受體表達陰性，而FcR陽性的靶細胞[22]。

WAN等[24]提出人冠狀病毒ADE的機制是針對S蛋白的抗體通過FcRⅡ介導人冠狀病毒進入細胞，與登革病毒促使免疫細胞發生ADE的機制類似，在敲除或表達MERSr-CoV高親和力受體——二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）的情況下，其單抗Mersmab1與MERSr-CoV結合，觸發S蛋白構象改變，激活蛋白酶水解，誘導病毒包膜與細胞膜融合。同時Mersmab1結合免疫細胞表面IgG FcR，通過典型的病毒受體依賴途徑感染細胞[24]。

CARDOSA等[25]的研究結果顯示，補體受體（complement recptor，CR）3能增強黃病毒感染巨噬細胞的能力。隨后有學者在對HIV-1的研究中發現，在亞中和水平HIV-1特異性抗體存在的情況下，CR3、C1q受體、CR2介導HIV-1抗原抗體復合物進入T淋巴細胞系[26-27]。而CR是否參與冠狀病毒的ADE，還有待于進一步研究加以驗證。

3 冠狀病毒ADE的影響因素

人冠狀病毒ADE受多種因素影響，包括病毒感染量、抗體水平、抗體與受體親和力、病毒受體和FcR的組織特異性表達等，探討核心因素并進行改造和消除，是當前ADE研究的重點。

3.1 包膜蛋白

人冠狀病毒包膜S蛋白在病毒吸附、融合、進入細胞及宿主免疫中起重要作用[28]。中和SARSr-CoV主要是通過阻斷S蛋白和ACE2之間的相互作用[29]。

S蛋白包含S1、S2亞基。S1亞基主要分為N端域（N terminal domain，NTD）和受體結合區（receptor binding domain，RBD），負責識別與結合細胞的受體。RBD主要由受體結合基（receptor binding motif，RBM）和核心區組成。不同冠狀病毒S蛋白的核心區高度保守，而在受體識別中發揮關鍵作用的RBM空間構象各有不同，這決定了冠狀病毒識別細胞受體的特異性[15]。針對冠狀病毒RBD的特異性抗體能與S蛋白RBD結合，產生中和作用。生物信息學分析結果顯示，不同的人冠狀病毒之間S蛋白有重疊區域，如hCoV-EMC和SARSr-CoV的S1亞基RBD氨基酸序列之間僅有16.6%的差異[21]。S2亞基含有膜融合過程所需的基本元件[15]。在感染過程中，人冠狀病毒首先通過S1亞基RBD與宿主細胞膜受體相互作用、結合，觸發S2亞基的構象變化，導致膜融合并進入靶細胞。

YUAN等[30]證實靶向人冠狀病毒RBD的特異性中和抗體能介導ADE。人冠狀病毒有2種狀態的RBD，分別是橫臥和直立狀態；而SARSr-CoV、MERSr-CoV的RBD均為直立狀態，這有利于與受體結合[30]。SARSr-CoV特異性抗體與ACE2對應的SARSr-CoV RBD結合，可穩定RBD的直立狀態并觸發S蛋白的構象變化[31]，并介導SARSr-CoVpp感染細胞導致ADE[24]。與SARSr-CoV相似，單克隆抗體需與MERSr-CoV S蛋白RBD結合并保持RBD的直立狀態，才能觸發MERSr-CoV S蛋白的構象變化，并將S2位點暴露給蛋白酶[15]，從而融合細胞膜，感染細胞。MERSr-CoV RBD中和抗體與病毒受體一樣，能與S蛋白RBD結合，并觸發RBD的構象變化，阻斷RBD與表達DPP4的細胞結合和病毒感染，而后通過FcR途徑感染人類細胞[24]，即RBD單克隆抗體通過功能性模仿病毒受體DPP4來介導冠狀病毒發生ADE。

WALLS等[16]的研究證實SARS-CoV-2 S蛋白可誘導機體產生中和抗體，是SARS-CoV-2診斷、治療和疫苗研發的重要靶標。既往研究結果表明，基于重組全長S蛋白的候選疫苗增強了SARSr-CoV感染THP-1、Raji B細胞、Daudi細胞和HL-CZ細胞的能力。來源于SARSr-CoV感染患者的高濃度抗體促進了SARSr-CoV感染人HL-CZ細胞及細胞凋亡，這種ADE現象與SARSr-CoV S蛋白有關，與N蛋白無關[32]。

3.2 與受體的親和力

不同的冠狀病毒株與ACE2的親和力不同，因此病毒的感染力、傳播力及造成的人體病理性改變也不同。有些病毒株可感染人類，但并不在人類之間傳播，而有些病毒株對人類細胞具有高感染力，可形成跨物種傳播。

YANG等[33]的研究結果顯示，SARSr-CoV特異性抗體是中和病毒，還是產生ADE，與病毒-受體親和力有關，即使用同源S蛋白免疫動物的抗血清，對人ACE2親和力較低的病毒更難以中和，更易出現ADE現象。而與人ACE2有高親和力的人源病毒株還未進化到可以逃避這種免疫選擇[33]。雖然人冠狀病毒NL63（human coronavirus NL63，hCoV-NL63）與SARSr-CoV屬于不同冠狀病毒屬，但二者均可通過與ACE2受體發生作用進入細胞。與SARSr-CoV相比，hCoV-NL63與ACE2的親和力較弱，僅導致輕微的呼吸道感染癥狀[34]。

WRAPP等[35]通過冷凍電鏡技術解析了SARS-CoV-2 S蛋白的三聚體結構，發現其更容易與細胞表面的ACE2結合，SARS-CoV-2與ACE2的親和力是SARSr-CoV S蛋白與ACE2親和力的10～20倍。YAN等[36]發現ACE2以二聚體的形式存在，同時具有開放和關閉2種構象，且2種構象都有冠狀病毒結合域，1個ACE2二聚體能結合2個SARSr-CoV的S蛋白。與ACE2的高親和力對SARS-CoV-2 ADE發生機制的影響仍需進一步證明。

3.3 抗體

有學者[5]發現，SARS-CoV-2患者在發病后第9天IgM抗體達到峰值，并在第2周轉換為IgG抗體。LIU等[37]發現SARSr-CoV感染機體后最早在發病第4天發生抗體轉換，大多數患者是在14 d后發生抗體轉換。特異性IgG抗體和中和抗體的存在時間可長達2年，以保護機體[37]。MERSr-CoV感染后在發病的第2周或第3周出現抗體轉換，且SARSr-CoV、MERSr-CoV引起的抗體反應時間和強弱均與疾病預后相關[38]。

WAN等[24]分析了不同劑量的MERSr-CoV高親和力單抗Mersmab1對MERSr-CoV ADE的影響，證實了復雜的抗體劑量依賴模式，細胞同時表達DPP4和FcR，可通過改變抗體劑量來確定DPP4依賴或抗體依賴的ADE途徑之間的平衡。他們認為MERSr-CoV ADE一般在中等抗體劑量下發生[24]，這與登革病毒的ADE僅在存在一定濃度的抗體時發生[39]相似。

在動物實驗中，基于SARSr-CoV全長S蛋白開發的候選疫苗被證明可誘導非中和抗體，這些抗體不但不能預防SARSr-CoV感染，不能保護免疫動物不受病毒感染，反而導致了疾病進展，如肝炎加重、發病率升高和更強的炎癥反應[40-41]。由于SARSr-CoV和MERSr-CoV在分類學和結構上的相似性，這2種病毒的新疫苗研發過程在很大程度上是相似的。許多針對MERSr-CoV的潛在疫苗也主要集中在相同的全長S蛋白上，這引起了學者們對這些疫苗實際應用安全性的關注[42]。

4 SARS-CoV-2 ADE相關研究展望

4.1 疫苗的研發

SARS-CoV-2作為新發現的人冠狀病毒，針對其免疫機制，尤其是ADE方面的研究甚少。總結、概括與SARS-CoV-2同源的人冠狀病毒的ADE研究進展，能為SARS-CoV-2抗體相關藥物開發、免疫治療及疫苗研發等提供一定的參考，甚至為今后可能再次發生的冠狀病毒跨種屬傳播提供一些背景信息。

自COVID-19疫情暴發以來，國內外很多生物制藥公司或學術機構都積極進行多種類型預防性疫苗的研發，包括mRNA、DNA、腺病毒載體和重組蛋白等[43]。而針對SARSr-CoV的多種疫苗，如滅活疫苗、減毒活疫苗、病毒和細菌載體疫苗、重組蛋白和DNA疫苗等已進入臨床試驗階段[44]。ADE是疫苗設計及研制的主要障礙，此過程中接種疫苗的個體的疾病進展比未接種疫苗的個體更為嚴重。免疫力低下、患有基礎疾病者更應重視及預防ADE的發生。針對S蛋白開發的候選疫苗存在ADE的風險，而同樣基于S蛋白的病毒載體疫苗誘導的中和性應答同樣存在引起ADE的可能[29]。

目前，有2種方法可以減輕ADE的不良影響：第1種方法是通過糖基化來屏蔽S蛋白的非中和表位；第2種方法是引導適應性免疫反應，只針對關鍵的中和表位，誘發更強的保護性免疫[45-46]。對第2種方法的支持證據是基于較短S1區的MERSr-CoV候選疫苗比基于全長S蛋白的疫苗有更強的中和活性[46]。此外，基于更短RBD的候選疫苗可誘導較高的中和免疫反應[46]。體外研究結果顯示，人冠狀病毒S蛋白RBD的單克隆抗體可通過模仿病毒受體的功能來介導ADE[24]。如果靶向中和性抗體中其他不觸發其構象變化的亞基，則可能不會引起ADE。基于相同的原理，可以選擇靶向S蛋白其他部位的中和性單克隆抗體來治療病毒感染。

4.2 動物模型的篩選

SARS-CoV-2 感染性動物模型的建立是進行疫苗研制及藥物篩選的關鍵環節。多種動物模型已被用于人冠狀病毒研究。表達人ACE2的轉基因小鼠AC70和AC63被開發為SARSr-CoV感染的動物模型。SARS-CoV-2同樣通過人ACE2受體進入細胞，這為SARS-CoV-2動物模型的開發提供了參考[47]。多種非人靈長類動物，如恒河猴、非洲綠猴、狨猴等都可感染SARSr-CoV，可用于SARSr-CoV感染模型的研究。SARSr-CoV感染不同種類的動物后，出現的癥狀不同[41-43]。恒河猴可自然感染MERSr-CoV，出現一系列輕度感染癥狀，不會出現致死性感染[44-46]。用同樣方式接種MERSr-CoV后，狨猴中部分感染動物可表現為致死性感染[47]。研究人員嘗試用捕獲的果子貍作為SARSr-CoV感染的動物模型，但果子貍感染SARSr-CoV后不出現重癥感染癥狀，不會導致死亡[48-49]。現有的研究結果顯示，僅在上述一小部分SARSr-CoV動物實驗中觀察到了ADE，如用表達SARSr-CoV S蛋白的安卡拉痘病毒載體免疫雪貂后，增加了動物體內的病毒載量，加重了肝臟病變，但在其他疫苗接種組中未觀察到ADE。不同動物模型和不同疫苗亞型、劑量、免疫方式等都影響著ADE的發生。目前尚未在體內實驗中觀察到MERSr-CoV的ADE現象[44]。如何有效地建立感染性動物模型并鑒定、評價疫苗是否有效是當前SARS-CoV-2疫苗研發面臨的重要問題。

目前，科學家正在對SARS-CoV-2進行層層剖析，包括病毒結構、與人ACE2受體的相互作用、病毒傳染性及流行病學等諸多方面。病毒的遺傳差異性高，其ADE的差別甚大，這種差異關系到疫苗的研發，因此有必要深入探討ADE在病毒致病機制中的地位和作用，從而對候選疫苗進行修飾處理或淘汰，以盡早研制出安全、有效的疫苗。