AFB1通過ROS-Caspase通路誘導的奶牛肝細胞凋亡

賈紅豆

（黑龍江八一農墾大學 生物技術中心，黑龍江 大慶 163319）

黃曲霉毒素是由生長在食品中的真菌（例如黃曲霉和寄生曲霉）作為次生代謝產物產生劇毒的化合物。黃曲霉毒素的主要關注點在于它們的致癌特性，這一點已通過大量動物實驗和一些流行病學研究證明，黃曲霉毒素的暴露與肝癌發病率的增加有關。此外，肉、奶、蛋和其他動物來源產品中的黃曲霉毒素殘留可能對人體健康造成額外危害。黃曲霉毒素B1（AFB1）污染的飼料喂養母牛的牛奶中檢測出黃曲霉毒素M1（AFM1）的殘留。此外，在牛的肌肉組織和雞蛋中發現了黃曲霉毒素的殘留[1]。在已知18種黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2被國際癌癥研究機構視為A類致癌物。其中，黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性和致癌作用最為嚴重[2]。它需要氧化8，9-乙烯基鍵以產生具有生物活性的AFB1-8，9-環氧化合物，該化合物可以與DNA，RNA和蛋白質反應導致組織細胞損傷。

奶牛養殖中使用的許多飼料成分（棉籽、花生、玉米、大豆、大米、干魚、蝦和魚粉）被認為是AFB1污染的主要來源。由于近年來飼料中霉菌毒素污染的問題日益嚴重，因此嚴重影響奶牛養殖業的健康發展。肝臟是動物機體主要的毒物代謝器官。AFB1進入肝臟后可以導致肝細胞氧化應激、凋亡損傷，誘導肝癌的發生。而AFB1對奶牛的毒性損傷報道較少。因此，本實驗通過采用不同濃度的AFB1處理奶牛肝細胞，研究AFB1對奶牛肝細胞氧化應激及凋亡的影響，為防治AFB1對奶牛毒性損傷提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 奶牛肝細胞的分離、培養和處理

收集犢牛肝臟，以分離原代肝細胞。通過兩步灌注法分離肝細胞[3]。無菌采集犢牛肝臟，將肝臟組織采用含有膠原酶的灌流液進行消化，隨后剪碎肝臟。依次使用100目（150 μM）和200目（75 μM）的細胞篩過濾肝細胞。在RPMI-1640基本培養基中清洗2次后，將肝細胞懸液在4℃下以500×g離心5 min。將分離的肝細胞接種到6孔板中，并在37 ℃，5% CO2條件下培養。隨后將分離和培養的奶牛肝細胞使用DMSO（對照組）及1、2和4 μM AFB1處理12 h。

1.2 ROS含量檢測

用DCFH-DA染色測定法測量細胞內ROS濃度。將細胞與25 μM DCFH-DA孵育20 min，然后用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，并重懸于PBS中，通過流式細胞儀測量細胞內ROS的含量。

1.3 SOD和GSH-Px的活性以及MDA的含量檢測

使用南京建城生物技術研究所（中國南京）的分光光度診斷試劑盒測定細胞中SOD和GSH-Px的活性以及MDA的含量。收集細胞并將其懸浮在PBS中，在560 nm（SOD），420 nm（GSH-Px）和532 nm（MDA）處檢測吸光度，并使用722N分光光度計（上海科學儀器有限公司）記錄吸光度。

1.4 蛋白提取和Western-blot實驗

使用蛋白質提取試劑盒從肝細胞中分離總蛋白質，使用BCA方法檢測蛋白質濃度。將蛋白質樣品通過SDS-PAGE分離，并將其轉移到0.45 m的PVDF膜上。在室溫下，將膜用3%BSA Tris緩沖鹽水/Tween緩沖液封閉4 h，然后與Caspase3和Caspase9抗體在4℃過夜。將膜洗滌3次，并與相應二抗在室溫下孵育45 min。用ECL化學發光溶液檢測蛋白條帶。

1.5 凋亡率檢測

收集細胞并用PBS洗滌2次，使用Annexin V-FITC/碘化丙啶凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。根據說明書步驟進行操作，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6 統計分析

數據用平均值±標準差的表示。采用oneway ANOVA法進行數據分析。P＜0.05表示差異顯著。P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 AFB1對ROS和MDA含量的影響

為了研究檢測AFB1是否可以誘導奶牛肝細胞氧化應激，本實驗采用不同濃度AFB1處理奶牛肝細胞。結果如圖1所示，與對照組相比，AFB1組奶牛肝細胞中ROS和MDA的含量顯著升高。隨著AFB1濃度升高，ROS和MDA的含量逐漸增加。說明AFB1可以誘導奶牛肝細胞氧化應激。

圖1 ROS和MDA含量

2.2 AFB1對SOD和GSH-Px活性的影響

結果表明，與對照組相比，AFB1組奶牛肝細胞中SOD和GSH-Px活性顯著降低（見圖2）。隨著AFB1濃度升高，SOD和GSH-Px活性逐漸下降。說明AFB1可以降低奶牛肝細胞抗氧化能力。

圖2 SOD和GSH-Px活性

2.3 AFB1對Caspase3和Caspase9蛋白表達的影響

結果表明，與對照組相比，AFB1組奶牛肝細胞中Caspase3和Caspase9蛋白表達量顯著升高（見圖3）。隨著AFB1濃度升高，Caspase3和Caspase9蛋白表達量逐漸增加。說明AFB1可以激活奶牛肝細胞Caspase凋亡通路。

圖3 AFB1對Caspase3和Caspase9蛋白表達的影響

2.4 AFB1對奶牛肝細胞凋亡的影響

結果表明，與對照組相比，AFB1組奶牛肝細胞凋亡率顯著升高（見圖4）。隨著AFB1濃度升高，凋亡率逐漸增加。說明AFB1可以誘導奶牛肝細胞凋亡。

圖4 AFB1對奶牛肝細胞凋亡的影響

3 討論

AFB1是毒性最高的黃曲霉毒素之一。研究發現AFB1對動物具有肝毒性，遺傳毒性和免疫毒性作用[4]。由于AFB1存在于奶牛飼料中，且對奶牛具有肝毒性和免疫毒性，可以導致奶牛產奶量降低，奶中AFB1殘留從而降低奶牛的生產性能。肝臟被認為是人類和動物中執行許多重要功能的最重要器官，同時也充當毒素的主要器官。大多數黃曲霉毒素（包括AFB1）在肝臟中以8，9-環氧形式結合DNA和蛋白質，誘導細胞凋亡，從而破壞肝臟的形態[5]。本研究發現，AFB1可以增加奶牛肝細胞中ROS和MDA的含量，降低肝細胞抗氧化能力，并激活Caspase凋亡通路，最終導致奶牛肝細胞凋亡。

氧化應激被認為是AFB1誘導肝毒性的關鍵因素。活性氧（ROS）的過度形成，細胞抗氧化能力降低會導致氧化應激的發生。在正常的細胞代謝過程中，線粒體產生ROS，包括氧離子，自由基和脂質氫過氧化物等[6]。然而，在沒有抗氧化劑機制來抵消這些分子的過量產生的情況下，氧化應激可直接增加蛋白質和DNA的損傷并誘導脂質過氧化物的產生，如，丙二醛（MDA）[7]，最終導致不可逆轉的細胞和組織損傷。研究發現AFB1可以導致豚鼠肝臟DNA和脂質損傷[8]。本研究發現，AFB1可以增加奶牛肝細胞中ROS和MDA的含量，且ROS和MDA的含量隨著AFB1濃度增加而升高。這些研究說明AFB1可以導致奶牛肝細胞氧化損傷。SOD和GSH-Px是清除ROS的主要功能酶。本研究發現，AFB1可以降低奶牛肝細胞中SOD和GSH-Px的活性，且SOD和GSH-Px的活性隨著AFB1濃度增加而降低。這些研究說明AFB1可以損害奶牛肝細胞抗氧化能力。

氧化應激導致細胞損傷的重要原因之一是導致細胞凋亡[9]。過量ROS的產生引起線粒體功能障礙，進而激活線粒體凋亡途徑。Caspase信號通知在控制線粒體凋亡途徑中起著關鍵作用。過量的ROS可激活Caspase9，活化的Caspase9裂解下游的caspase，如Caspase3，從而啟動Caspase級聯反應，導致細胞凋亡[10]。本研究發現，AFB1可以增加奶牛肝細胞中Caspase3和Caspase9蛋白表達量及細胞凋亡率，且Caspase3和Caspase9蛋白表達量及細胞凋亡率隨著AFB1濃度增加而升高。這些研究說明AFB1可以激活ROS-Caspase凋亡通路，誘導奶牛肝細胞凋亡。

綜上所述，本試驗研究表明AFB1可以導致奶牛肝細胞氧化應激，隨后激活Caspase凋亡通路，繼而誘導奶牛肝細胞凋亡。