伴微浸潤的乳腺導(dǎo)管原位癌中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞分布狀態(tài)分析

阮瑩?林瓊林?關(guān)結(jié)霞?趙暢

【摘要】目的 回顧性分析乳腺導(dǎo)管原位癌（DCIS）患者的臨床病理資料，探討伴微浸潤的DCIS中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）的分布情況。方法 74例乳腺DCIS患者作為研究對象，不伴微浸潤的DCIS（pure-DCIS）共42例作為對照組，伴微浸潤的DCIS（mi-DCIS）32例作為實(shí)驗(yàn)組，分析其臨床病理資料及TILs分布的差異，并進(jìn)一步對mi-DCIS組原位癌及微浸潤區(qū)域的TILs密度進(jìn)行對比。結(jié)果 400倍高倍鏡下，mi-DCIS組熱點(diǎn)區(qū)域及平均值區(qū)域TILs百分比分別為57.50（18.75，80.00）%，8.00（5.00，15.00）%，pure-DCIS組分別為5.00（1.00，16.25）%，1.00（1.00，5.00）%，無論是熱點(diǎn)區(qū)域還是平均值，mi-DCIS組TILs百分比均高于pure-DCIS組（P均< 0.001）。mi-DCIS組中微浸潤灶處平均TILs比例為15.00 （5.00， 50.00）%，高于原位癌區(qū)域8.00（5.00，15.00）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.004）。結(jié)論 相較于pure-DCIS，mi-DCIS中TILs的分布密度明顯增高;mi-DCIS中，微浸潤灶處TILs的分布情況較整體有上升的趨勢。

【關(guān)鍵詞】乳腺導(dǎo)管原位癌;腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞;微浸潤;分布狀態(tài)

Analysis of distribution pattern of tumor-infitrating lymphoctyes in breast ductal carcinoma in situ complicated with microinfiltration Ruan Ying， Lin Qionglin， Guan Jiexia， Zhao Chang. Department of Thyroid and Breast Surgery， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Zhao Chang， E-mail： zhaoch43@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To retrospectively review the clinocopathological data of patients with breast ductal carcinoma in situ （DCIS）， and explore the distribution pattern of tumor-infiltrating lymphocytes （TILs） in DCIS patients complicated with microinfiltration. Methods Seventy-four DCIS patients were recruited in this study. Among them， 42 patients with pure DCIS （pure-DCIS） were assigned into the control group， and 32 cases of DCIS complicated with microinfiltration （mi-DCIS） were allocated into the experimental group. The clinicopathological data and TILs distribution were analyzed. Moreover， the TILs density between the DCIS area and microinfiltration area were statistically compared in the mi-DCIS group. Results Under 400× microscope， the hot spot and average TILs percentages were 57.50（18.75， 80.00）% and 8.00（5.00， 15.00）% in the mi-DCIS group，and 1.00（1.00， 5.00）% and 5.00（1.00， 16.25）% in the pure-DCIS group， respectively. Regardless of the hot spot or average value， the TILs percentages in the mi-DCIS group were significantly higher than those in the pure-DCIS group （both P < 0.001）. In the mi-DCIS group， the average proportion of TILs in the micro-infiltrating lesions was 15.00（5.00， 50.00）%， significantly higher compared with 8.00（5.00， 15.00）% in the carcinoma in situ area （P = 0.004）. Conclusions Compared with pure-DCIS alone， the density of TILs distribution in mi-DCIS is significantly enhanced. In the mi-DCIS group， the distribution of TILs in the micro-infiltrating lesions tends to elevate compared with the overall distribution pattern.

【Key words】Breast ductal carcinoma in situ;Tumor-infiltrating lymphocyte;Microinfiltration;

Distribution pattern

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）是近年來腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。TILs是指聚集在腫瘤病灶區(qū)域內(nèi)的免疫淋巴細(xì)胞，包括B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，參與腫瘤免疫與免疫抑制的復(fù)雜過程[1-3]。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，TILs的分布與乳腺癌的預(yù)后相關(guān)，尤其在三陰性乳腺癌及人表皮生長因子受體2（HER-2）過表達(dá)型乳腺癌中，TILs的百分比與浸潤性乳腺癌患者的預(yù)后呈正相關(guān)[4]。但是在乳腺導(dǎo)管原位癌（DCIS）中，TILs的相關(guān)研究不多，其浸潤情況及與預(yù)后關(guān)系的報(bào)道結(jié)果不一，針對伴有微浸潤的DCIS（mi-DCIS）中TILs分布情況的報(bào)道更是少見[4-5]。根據(jù)2010年美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）指南，微浸潤被定義為腫瘤細(xì)胞突破基底膜但浸潤深度小于1 mm，mi-DCIS是乳腺原位癌中的一種特殊類型，其與不伴微浸潤的單純DCIS（pure-DCIS）、浸潤性癌在生物學(xué)特性及預(yù)后上均不盡相同，針對其中TILs分布狀態(tài)僅有零星小樣本報(bào)道，相關(guān)研究較缺乏[6]。因此，本文回顧性分析了74例DCIS患者（其中伴微浸潤32例），分析其臨床病理資料，探討mi-DCIS中TILs的分布情況。

對象與方法

一、研究對象

本研究以中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院甲狀腺乳腺外科于2014年1月至2020年12月診斷為乳腺DCIS的所有住院患者為研究對象。排除標(biāo)準(zhǔn)：初診即為復(fù)發(fā)病例、新輔助化療病例、未行根治性手術(shù)、伴有其他器官轉(zhuǎn)移以及因各種原因無法獲取手術(shù)標(biāo)本的病例。回顧性采集患者年齡、性別、術(shù)前檢查[含彩色多普勒超聲（彩超）、鉬靶等]等臨床資料。所有患者已接受根治性手術(shù)（乳腺癌改良根治術(shù)或保乳手術(shù)）治療。

二、方 法

1.組織學(xué)判定

所有入組病例均采用手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)過甲醛固定、石蠟包埋、切片及HE染色處理。病理玻片由2位專科醫(yī)師共同閱片，采用《WHO 2020乳腺腫瘤病理分類標(biāo)準(zhǔn)》，判定pure-DCIS及mi-DCIS病例，以及雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、HER-2、Ki-67等免疫組織化學(xué)（組化）指標(biāo)讀取（mi-DCIS組中，以上數(shù)據(jù)僅評判總體平均值）[7]。同時(shí)采集腫瘤大小、病理分級、有無壞死、有無粉刺樣變、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等資料。其中ER、PR > 1%定義為陽性，HER-2免疫組化結(jié)果（+++）或免疫組化結(jié)果（++）、熒光原位雜交結(jié)果陽性定義為陽性，否則為陰性。根據(jù)《中國臨床腫瘤學(xué)會乳腺癌診療指南2019》，Ki-67 > 30%被定義為高表達(dá)[8]。

2.TILs分布情況判定

TILs的分布情況由2位病理科專科醫(yī)師判定，根據(jù) 《WHO 2020乳腺腫瘤病理分類標(biāo)準(zhǔn)》分別判斷pure-DCIS與mi-DCIS組TILs的分布狀態(tài)，記錄包含200、400倍高倍鏡下熱點(diǎn)區(qū)域及平均TILs百分比。另外，對于mi-DCIS組，為了觀察mi-DCIS組微浸潤灶與總體TILs的一致性，進(jìn)一步分別采集原位癌區(qū)域TILs與微浸潤灶區(qū)域TILs分布的百分比作對比（因微浸潤灶病灶較小，熱點(diǎn)區(qū)域判定可能存在明顯誤差，故此部分研究只對比微浸潤灶與總體TILs的平均值）。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分類資料用例（%）表示，其中無序分類資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，等級資料組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的連續(xù)型變量用中位數(shù)（下四分位數(shù)、上四分位數(shù)）表示，組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)，mi-DCIS組原位癌區(qū)域與微浸潤灶區(qū)域TILs百分比的比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)。 P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、2組基本臨床及病理資料對比

符合入組標(biāo)準(zhǔn)的DCIS患者共74例，其中pure-DCIS組42例，mi-DCIS組32例。所有患者均為女性，年齡24 ～ 84歲，中位年齡為48歲。pure-DCIS組和mi-DCIS組各有5例患者小于35歲，2組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.643）。pure-DCIS組和mi-DCIS組分別有16例、12例患者為多灶性病例，2組多灶性情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.958）。2組病理級別、粉刺樣變、HER-2陽性比例比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05或0.001）;壞死、ER陽性、PR陽性以及Ki-67高表達(dá)比例比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見表1。

二、pure-DCIS組與mi-DCIS組TILs分布情況對比

pure-DCIS組及mi-DCIS組各病例中有不同程度的TILs分布，見圖1。400倍高倍鏡下，無論是熱點(diǎn)區(qū)域還是平均值，mi-DCIS組TILs百分比均高于pure-DCIS組，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05）;200倍高倍鏡下也有一致的結(jié)果，見表2。

三、mi-DCIS病例中微浸潤灶TILs分布情況。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對于mi-DCIS組病例，因微浸潤灶普遍較小，故原位癌區(qū)域TILs分布情況與總體基本一致。pure-DCIS組中，400倍高倍鏡下，微浸潤灶處平均TILs為15.00（5.00，50.00）%，高于總體TILs百分比[8.00（5.00，15.00）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z = -2.844，P = 0.004）。200倍高倍鏡下，微浸潤灶處平均TILs為12.00（5.00，23.75）%，與總體[5.00（5.00，12.00）%]比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z = -1.917，P = 0.055）。

討論

近年來，隨著關(guān)于腫瘤微環(huán)境研究的深入，腫瘤免疫微環(huán)境成為乳腺癌研究的熱點(diǎn)話題。在浸潤性癌中，高TILs百分比已被認(rèn)為是三陰性及HER-2陽性乳腺癌預(yù)后良好的指標(biāo)，提示TILs可能存在抗腫瘤作用[9]。但針對原位癌，TILs的保護(hù)作用則仍富有爭議。Pruneri等[10]發(fā)表的一項(xiàng)納入1488例患者的回顧性分析表明，TILs分布情況與DCIS預(yù)后無關(guān)。甚至有研究表明，DCIS中TILs比例增高，與預(yù)后不良因素有關(guān)。2019年Darvishian等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在DCIS中TILs比例> 30%的病例中年輕患者、大腫瘤、高級別腫瘤、粉刺樣變及壞死等的比例明顯較高。這似乎意味著與浸潤性癌不同，高TILs比例在DCIS中并不是預(yù)后良好的因素，其向浸潤性癌發(fā)展的可能性更高。對于mi-DCIS的分析可能能回答此項(xiàng)矛盾，并對腫瘤免疫微環(huán)境的作用解讀富有重要意義。但目前針對mi-DCIS中TILs分布情況的研究仍較缺乏。本研究結(jié)果表明相較于pure-DCIS，mi-DCIS中TILs的分布密度明顯增高;mi-DCIS中，微浸潤灶處TILs的分布情況較整體有上升的趨勢。

作為DCIS中的一種特殊類型，微浸潤被認(rèn)為是pure-DCIS向浸潤性癌過度的過程[11]。既往報(bào)道表明，mi-DCIS病例的復(fù)發(fā)率明顯高于pure-DCIS病例，且在mi-DCIS往往有更高比例的ER陰性、HER-2陽性患者，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率也更高[12]。在與pure-DCIS組對比中，本研究發(fā)現(xiàn)mi-DCIS組中高級別DCIS、粉刺樣變、HER-2陽性等預(yù)后危險(xiǎn)因素確實(shí)高于pure-DCIS組，而與之對應(yīng)的TILs比例亦顯著增高。這與此前另外一篇報(bào)道的結(jié)果類似[6]。同時(shí)，本研究還深入對比了微浸潤灶處TILs的分布情況與整體的差異，結(jié)果表明，高倍鏡下微浸潤灶TILs百分比明顯上升，在低倍鏡下也有上升的趨勢。表明mi-DCIS免疫微環(huán)境的確與pure-DCIS存在差異。針對這種趨勢，筆者推斷可能存在以下兩個(gè)方面的原因：一是TILs在腫瘤浸潤的過程中扮演了促進(jìn)作用。既往研究表明，除了具有殺腫瘤作用的CD8+ T淋巴細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞等成分外，TILs中還存在具有免疫抑制細(xì)胞，包括調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞等，能分泌免疫抑制因子，提高腫瘤的浸潤及原處轉(zhuǎn)移能力，能在DCIS向浸潤性癌發(fā)展的過程中起促進(jìn)作用;另一種解釋是DCIS浸潤的過程中，激活了免疫，促進(jìn)了TILs的聚集[13]。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果類似，高TILs的DCIS中ER陽性、HER-2陽性的病例比例更高，而此類腫瘤，也具有更強(qiáng)的免疫原性，其在浸潤的過程中，促進(jìn)了TILs的聚集[7， 14]。雖然以上推斷仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，但仍說明對mi-DCIS中免疫微環(huán)境的進(jìn)一步研究，對了解乳腺癌的浸潤過程、免疫反應(yīng)等具有較大的意義。

腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有復(fù)雜而重要的意義，為腫瘤的免疫治療提供了新的思路與靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微浸潤這一種特殊狀態(tài)下TILs的變化，也為抑制腫瘤治療的研究提供了新的思路——深入研究不同腫瘤狀態(tài)下腫瘤免疫微環(huán)境的變化，可能為利用免疫治療抑制腫瘤浸潤性提供新的研究方向。

綜上所述，mi-DCIS中TILs的分布密度較pure-DCIS中明顯增高，且微浸潤灶處TILs的分布密度更高，說明mi-DCIS中腫瘤免疫微環(huán)境具有特殊性，值得進(jìn)一步深入研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-12-20）

（本文編輯：楊江瑜）