外泌體來源的微RNA在心血管疾病中的作用及中藥干預的研究進展

楊林靜，宗文靜

(首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069)

《中國心血管病報告2018》顯示，我國心血管病的患病率和病死率仍處于上升階段，目前我國心血管病患病人數約為2.9億，病死率超過40%[1]。心血管疾病嚴重危害人類的身心健康，防治心血管疾病已成為目前醫學研究的重點。外泌體介導了心臟細胞間的信息傳遞，隨著其內容物微RNA(microRNA，miRNA)的發現，外泌體來源的miRNA在心血管系統中的作用機制逐漸成為研究熱點。研究表明，外泌體來源的miRNA與心血管疾病的發生、發展密切相關[2]。外泌體內的特定miRNA參與心血管的病理、生理及修復再生等環節，具有促進血管生成、細胞增殖以及抑制纖維化、抗炎等作用[3]。目前雖然已進行了大量研究，但外泌體來源的miRNA在心血管疾病中的調控機制仍不明確。傳統中藥對心血管疾病有較好的療效，但存在有效成分溶解率低、生物利用度不高、療程較長等不足，而利用外泌體可以更好地遞送中藥的有效成分[4]。部分研究者也正聚焦于中藥對心血管疾病中外泌體來源的miRNA作用機制的研究[5]，期待可以更好地發揮中藥的療效。現就外泌體來源的miRNA在心血管疾病中的作用及中藥干預機制的研究進展予以綜述。

1 外泌體的基本特征

1.1外泌體的構成 外泌體是由細胞分泌至細胞外的直徑為30～100 nm的雙層囊泡狀小體[6]，攜帶多種信息成分，包括蛋白質、脂類、miRNA、長鏈非編碼RNA和信使RNA等。研究顯示，外泌體表面已被識別的蛋白包括熱激蛋白、轉膜蛋白和融合蛋白、多囊泡體生成相關蛋白、四次跨膜蛋白(如CD9、CD63、CD81和CD82)、脂質相關蛋白以及外泌體來源的細胞特異性蛋白等[7]。雖然外泌體的外膜也是脂質雙分子層結構，但雙層脂質膜可為外泌體內容物提供保護，防止miRNA被分解，保證了miRNA在體液中有較好的穩定性[8]。

1.2外泌體的形成和分泌 不同來源的細胞均可形成外泌體，其形成機制大致相同。首先，細胞內的內涵體通過向細胞腔內發芽而形成多囊泡體，此過程需要在內吞轉運復合體及相關蛋白(如腫瘤易感基因101、CD63)的調控下進行；隨后，在Rab家族鳥苷三磷酸酶的作用下，多囊泡體與細胞膜融合，并將腔內的多個囊泡釋放到細胞外基質中，形成外泌體[9]。多種不同類型的細胞均可分泌外泌體，如血細胞、干細胞、內皮細胞、淋巴細胞、血小板以及平滑肌細胞等[10]；外泌體廣泛存在于體液中，如尿液、唾液、乳液、血液、胸腔積液、心包積液以及腦脊液等[11]。

2 外泌體來源的miRNA及其生物學特征

2007年，Valadi等[12]首次于肥大細胞分泌的外泌體中發現了miRNA，自此有關外泌體來源的miRNA的研究越來越多。研究證實，外泌體來源的miRNA參與心血管發育、再生和修復過程，對心臟功能具有促進或抑制作用[13]。

miRNA是一段長為19～25個核苷酸的內源性單鏈RNA分子，細胞核內的miRNA相關基因序列經過轉錄、切割，生成前體miRNA，再由蛋白轉運至細胞質，在細胞質內質網進一步剪切修飾為成熟的雙鏈RNA，其中一條單鏈作為客鏈被降解，另一條單鏈與RNA誘導的沉默復合體結合形成成熟的miRNA[14-16]；隨后，miRNA與信使RNA 3′端的堿基序列互補結合，導致RNA降解或抑制信使RNA靶蛋白的翻譯，調節基因表達[17]。目前研究證實，外泌體來源的miRNA有兩大功能：①常規功能，即基因調控功能，一個miRNA往往能夠調控上百個信使RNA和蛋白質的表達；②配體功能，外泌體來源的miRNA可以作為配體與Toll樣受體結合[18]。miRNA被包裹在外泌體內，通過自分泌、旁分泌的方式作用于靶細胞，影響細胞功能，以此介導細胞間的信號傳遞[19]。這一過程依賴于外泌體雙層脂質膜良好的穩定性，防止miRNA在循環中被核酸酶降解，同時，外泌體膜還可抵御不同的低溫環境，為其內容物提供良好的儲存條件[20]。

3 外泌體來源的miRNA在心血管疾病中的作用

3.1動脈粥樣硬化 動脈粥樣硬化的發病機制較為復雜，與內皮細胞損傷、平滑肌細胞增殖、血栓形成以及炎癥細胞浸潤等密切相關。Hergenreider等[21]將表達Krüppel樣因子2的血管內皮細胞來源的外泌體注入高脂飲食飼養的ApoE-/-小鼠體內，結果發現，與對照組相比，實驗組小鼠動脈粥樣硬化面積顯著縮小；進一步研究證實，外泌體內富含的miR-143和miR-145被平滑肌細胞攝取，抑制了平滑肌細胞增殖，發揮了抗動脈粥樣硬化作用。有研究顯示，外泌體來源的miR-126可以為內皮細胞提供保護，miR-126通過調節G蛋白信號轉導調控因子16，縮小斑塊面積，減少巨噬細胞滲透[22]。還有研究顯示，血小板來源的外泌體富含的miR-320可以下調細胞間黏附分子1的表達，減少炎癥和血栓形成，起到抗動脈粥樣硬化的作用[23]。Yao等[24]研究表明，血小板來源的外泌體富含的miR-25-3p可抑制ApoE-/-小鼠冠狀血管內皮的炎癥反應，其機制是外泌體富含的miR-25-3p通過抑制核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路延緩炎癥進程，進而抑制動脈粥樣硬化的發展。另有研究表明，經氧化型低密度脂蛋白處理的人臍靜脈內皮細胞可激活NF-κB信號通路，誘導人臍靜脈內皮細胞來源的外泌體內miR-505表達增加和網狀結構形成，加重動脈粥樣硬化的進程[25]。由此可見，外泌體來源的miRNA不僅可抑制動脈粥樣硬化的發展，還可促進動脈粥樣硬化斑塊的形成。血管平滑肌細胞分泌的外泌體miR-155從平滑肌細胞轉移到內皮細胞，進而破壞內皮屏障的完整性，導致內皮通透性增加和動脈粥樣硬化進展增強，該過程可能與Krüppel樣因子5有關，而阻斷外泌體介導的miR-155在平滑肌細胞與內皮細胞間的轉移，可能成為治療動脈粥樣硬化的新靶點[26]。

此外，炎癥反應在動脈粥樣硬化發生、發展過程中也扮演重要角色。巨噬細胞在調節炎癥應答方面起重要作用，巨噬細胞來源的外泌體分泌的miR-124升高，抑制了巨噬細胞活化，使炎癥細胞滲透減少，發揮抗炎作用[27]。外泌體來源的miRNA在動脈粥樣硬化發展的各個環節均具有關鍵作用，如何提高miR-126、miR-25-3p、miR-124等外泌體來源的miRNA的表達水平可能是未來研究的方向。

3.2心力衰竭 在心力衰竭發生后，外泌體中的miRNA水平會發生改變，如miR-1、miR-21、miR-133a/b以及miR-214水平在心力衰竭過程中會增高，發揮保護心肌細胞的作用[28]。研究表明，心肌梗死后出現新發心力衰竭患者的血漿外泌體miR-192、miR-194和miR-34a的表達水平均增高[29]。Qiao等[30]通過體外實驗證實，心力衰竭患者基質細胞來源的外泌體富含的miR-21-5p表達失調，恢復miR-21-5p表達可改善心肌受損；進一步研究表明，miR-21-5p通過抑制人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因，增強蛋白激酶B的活性，從而促進血管生成和心肌細胞存活。而間充質干細胞來源的外泌體miR-221表達增加可降低p53上調凋亡調控因子的表達，減少心肌細胞凋亡，增強心臟的保護作用[31]。

3.3心肌梗死 心肌梗死是心臟疾病中的急危重癥，早期快速診斷對疾病的治療及預后均具有重要意義。Kuwabara等[32]研究發現，在心肌梗死區及梗死周邊區，心肌細胞受損后其外泌體含有的miR-1和miR-133a釋放入血，導致血漿中的miR-1和miR-133a水平均升高，提示外泌體來源的miRNA可作為診斷心血管疾病的潛在標志物，為早期診斷心肌梗死提供幫助。Luo等[33]研究表明，在缺氧誘導過程中，脂肪干細胞來源的外泌體富含的miR-126過表達可以下調炎癥因子的表達，減輕H9C2心肌細胞損傷，促進微血管生成和遷移，同時還可以通過減少纖維化相關蛋白質的表達降低心肌纖維化程度，這可能是心肌梗死后外泌體miR-126改善心臟功能的機制。此外，外泌體來源的miR-1、miR-126還可通過抑制Spred蛋白的表達，促進新生血管的形成[34]；骨髓間充質干細胞來源的外泌體miR-132過表達，可調節Ras/促分裂原活化的蛋白激酶通路，促進心肌梗死區新生血管的形成[35]。人子宮內膜來源的間充質干細胞外泌體miR-21可促進心肌梗死后血管生成，且miR-21對心臟的保護作用優于骨髓來源和脂肪來源的間充質干細胞，提示人子宮內膜來源的間充質干細胞可能成為治療心血管疾病的首選細胞[36]。

心臟祖細胞來源的外泌體通過miR-146a抑制心肌細胞的凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷，縮小心肌梗死面積[37]。有研究顯示，向急性心肌梗死小鼠注射胚胎干細胞來源的含有miR-22的外泌體，可以下調甲基化CpG結合蛋白2，從而刺激血管生成，減小梗死面積，改善心臟功能[38]。另外，骨髓間充質干細胞外泌體分泌的miR-301可能通過抑制心肌細胞自噬，減少心肌梗死面積[39]。

3.4心肌病 外泌體來源的miRNA在心肌病的發展過程中也有重要作用。Wang等[40]通過研究糖尿病心肌病小鼠發現，心肌細胞來源的外泌體miR-320水平增高，而胰島素樣生長因子1、熱激蛋白20和內皮素2水平均降低，導致心臟內皮血管生成功能受損，敲除miR-320則可以消除心臟內皮血管生成受損，這也證實了miR-320水平增高可抑制小鼠心臟內皮細胞遷移和新生血管形成。另有研究顯示，圍生期心肌病患者內皮細胞來源的外泌體miR-146a在催乳素的誘導下表達增高，從而抑制血管生成[41]。此外，外泌體來源的miRNA也可抑制心肌病的發展進程，保護心臟功能。間充質干細胞源性的外泌體分泌的miR-22、miR-146和miR-210均能阻斷糖尿病性心肌病小鼠的轉化生長因子-β信號通路，減輕心肌纖維化，改善心功能[42]。骨髓間充質干細胞來源的外泌體miR-223在膿毒性心肌病中具有保護作用，可能是由于miR-223可下調信號轉導及轉錄激活因子3的表達，并可減輕炎癥反應的發生[43]。

3.5心肌纖維化 高血壓使心臟長期超負荷、壓力增大，以致發生病理性心肌重構，同時伴隨心肌肥厚和心肌纖維化形成。研究表明，機械牽張刺激后，心肌細胞中的miR-378以外泌體途徑進入心肌成纖維細胞，導致miR-378水平增加，并通過調節p38促分裂原活化的蛋白激酶和信號轉導及轉錄激活因子3信號通路抑制成纖維細胞中與纖維化相關的信使RNA和蛋白的表達，進而抑制心肌纖維化的形成[44]。還有研究表明，心力衰竭患者血漿細胞以及經血管緊張素Ⅱ處理的心肌成纖維細胞外泌體中miR-425和miR-744的水平均降低，而miR-425和miR-744可通過抑制轉化生長因子-β1的表達，降低受體蛋白的表達，從而抑制心肌纖維化，提示血漿外泌體中的miR-425和miR-744可能成為預測心肌纖維化和心力衰竭的標志物[45]。對于急性心肌梗死導致的心肌纖維化，已有研究表明，間充質干細胞來源的外泌體miR-22可以通過結合甲基化CpG結合蛋白2，抑制心肌細胞纖維化，減輕急性心肌梗死后心肌壞死纖維化程度[46]。此外，骨髓間充質干細胞來源的外泌體miR-29和miR-24的表達增高以及miR-2、miR-15、miR-34和miR-130等表達降低，均能夠抑制心肌纖維化及炎癥進程，改善心肌梗死后小鼠的心功能[47]。

4 中藥對心血管疾病中外泌體來源的miRNA的靶向干預作用

4.1復方中藥 補陽還五湯是治療因虛致瘀腦卒中后遺癥的常用中藥復方，在臨床上廣泛應用于氣虛血瘀型的心血管疾病，如冠心病、高血壓等，均有較好的療效[48]。研究表明，補陽還五湯的有效成分可增加骨髓間充質干細胞來源的外泌體miR-126表達，降低miR-221和miR-222的表達，同時還可激活血管內皮生長因子，促進血管生成，減輕缺血性疾病的損傷[49]。miR-126可促進腺苷酸活化蛋白激酶的表達，而且可激活成纖維細胞生長因子和血管內皮生長因子，促進血管生成，說明補陽還五湯中的有效成分能通過外泌體調控相應miRNA的表達，促進血管生成，改善缺血[50]。

通心絡是由人參、酸棗仁、赤芍、檀香、降香、水蛭、蟬蛻、蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、乳香以及冰片12味中藥組成的復方提取物，臨床可用于冠心病心絞痛、急性心肌梗死以及缺血性腦卒中的治療。現有研究表明，通心絡可以減少高脂飲食飼養的ApoE-/-小鼠的斑塊面積，具有抗動脈粥樣硬化作用；通心絡還可通過抑制外泌體miR-155的分泌、阻斷miR-155的表達，達到抗動脈粥樣硬化的目的[51]。

4.2中藥單體

4.2.1丹皮酚 丹皮酚是中藥牡丹皮的提取物，具有抗動脈粥樣硬化的作用，是治療心血管疾病的常用藥。Liu等[52]研究表明，口服丹皮酚的高脂ApoE-/-小鼠主動脈粥樣斑塊較對照組(未口服丹皮酚的高脂ApoE-/-小鼠)顯著減少，體內實驗證實，丹皮酚可抑制動脈粥樣硬化的發展，增加內皮細胞來源的外泌體miR-223表達，降低內皮細胞中信號轉導及轉錄激活因子3和磷酸化信號轉導及轉錄激活因子3的表達；同時進一步闡明，丹皮酚在體內外對血管炎癥反應的保護機制與miR-223相關，增加miR-223的表達可降低內皮細胞的炎癥反應。研究顯示，丹皮酚可通過增加高脂血癥大鼠血漿外泌體miR-223的表達，抑制下游核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體信號通路，減輕大鼠主動脈內皮細胞的炎癥，起到抗動脈粥樣硬化的作用[53]。

4.2.2姜黃素 姜黃素是從姜科姜黃屬植物中提取的多酚類物質，藥理作用廣泛，毒性低，耐受性好。現有研究已經證實，姜黃素具有抗炎、抗血脂、抗氧化以及抑制血小板聚集等特性[54]。高同型半胱氨酸血癥可導致動脈粥樣硬化的發生，經姜黃素處理的細胞外泌體可以減輕高同型半胱氨酸血癥導致的內皮細胞損害，但其具體作用機制目前尚未明確[55]。另有研究顯示，經姜黃素處理后，慢性粒細胞白血病細胞釋放的外泌體組成發生了改變，其外泌體富含的miR-21進入內皮細胞，從而下調人臍靜脈內皮細胞中Ras同源物基因家族成員B的表達，維持內皮屏障穩定，同時姜黃素還減弱了外泌體的促血管生成作用[56]。維持血管內皮穩定可以減少動脈粥樣硬化斑塊破裂的風險，可能為動脈粥樣硬化的治療提供新思路。

4.2.3淫羊藿苷 淫羊藿苷是中藥淫羊藿的主要活性成分之一，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調節等藥理作用[57]。隨著研究的不斷深入，淫羊藿苷對心血管疾病的防治作用已得到證實[58]。現有研究證明，淫羊藿苷可以顯著提高缺氧條件下間充質干細胞的增殖活性，抑制細胞凋亡，同時還可提高多種促血管生成相關miRNA在細胞和外泌體的表達；低濃度淫羊藿苷對外泌體miR-126的表達有顯著的促進作用，miR-126經過旁分泌的方式作用于心內膜，并通過SPRED1(sprouty-related protein with an EVH1 domain 1)和磷酸肌醇-3-激酶調控亞基2介導的血管內皮生長因子信號通路，促進內皮細胞內環境穩定和血管生成，在缺血性疾病中發揮積極作用[59]。

5 小 結

外泌體參與細胞間信號轉導和物質傳遞，其分泌的miRNA在心血管疾病的發生、發展中起重要作用。外泌體來源的miRNA具有促進血管生成、調控細胞凋亡、抗炎、抑制纖維化等作用，在心血管疾病的治療方面有良好的應用前景。中藥及其有效成分可以通過調節外泌體來源的miRNA的表達，發揮對心血管疾病的調控作用，這可能為臨床治療及新藥研發提供新的思路。但該領域的研究尚處于起步階段，仍需進一步深入探究中藥對外泌體來源的miRNA的靶向干預機制。此外，對于同種疾病的不同證型，中藥對外泌體miRNA的影響是否會發生改變等也仍有待深入探討。相信未來外泌體來源的miRNA可能會成為中醫藥防治動脈粥樣硬化的新靶點。