胃癌組織中HIF-1α，CD68及CD206在胃癌及癌旁組織中的表達及臨床意義

周太成，馬寧，黃恩民，馬濤，陳嘉林，陳雙

越來越多研究表明巨噬細胞（Mφ）是腫瘤微環(huán)境中最重要的炎性細胞之一，其表面標記物CD68蛋白的高表達與胃癌病人不良預后顯著相關(guān)［1］。缺氧是幾乎所有人類實體瘤的典型特征，高增殖的腫瘤細胞比脈管系統(tǒng)發(fā)育得更快，因而呈缺氧狀態(tài)［2］。其中，低氧誘導分子-1α（HIF-1α）是HIF-1的活性亞基，也是腫瘤組織缺氧的標志物；而缺氧的微環(huán)境引起一系列事件發(fā)生，包括血管生成、能量代謝改變、免疫破壞、持續(xù)增值信號及侵襲轉(zhuǎn)移等，明顯影響腫瘤患者的預后［7］。同時，作為實體腫瘤微環(huán)境（TME）中數(shù)量最多的免疫細胞，腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）優(yōu)先聚集在腫瘤缺氧區(qū)，并主要極化成 M2 型巨噬細胞［8］。而 M2 巨噬細胞可通過增強腫瘤血管生成、組織重塑及轉(zhuǎn)移促進腫瘤進展［9］。因此，M2 型巨噬細胞表面標記物CD206 的表達高低也影響腫瘤患者的預后狀態(tài)。此外，缺氧的腫瘤微環(huán)境同時可以招募巨噬細胞，并調(diào)節(jié)巨噬細胞向 M2 型活化和極化［10，11］。腫瘤干細胞（CSCs）是一種被認為能夠促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的細胞亞群，在乳腺癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中均被發(fā)現(xiàn)并起著重要的作用［12］。缺氧和TAM 均可引起腫瘤細胞的干細胞化，對干細胞的自我更新和維持分化扮演者關(guān)鍵的角色［13-15］。

本研究初步探討 HIF-1α、CD68、CD206 蛋白表達與胃癌臨床病理相關(guān)性，對預測胃癌患者預后，進一步加深對胃癌發(fā)生發(fā)展的認識有重要價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集 2016 年 1 月-2018 年 1 月在中山大學附屬第六醫(yī)院手術(shù)切除的胃癌標本，均經(jīng)術(shù)后病理確診。其中，男 33 例，女10 例；年齡 39～78 歲，平均年齡58.8 歲。所有患者術(shù)前均未接受放化療治療，取距癌旁3～5 cm 的正常組織作為對照。

1.2 方法

鼠抗人 HIF-1α、CD68、CD206 單克隆抗體均購自廣州佳研生物有限公司。參照抗體說明書步驟檢測三種蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達：恒溫及酒精脫蠟；梯度酒精脫水；抗原修復；山羊血清封閉；封閉一抗二抗；DAB 顯色；蘇木精復染；封片、觀察；以PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.3 圖片觀察

免疫組化染色后的切片在正置顯微鏡200 倍下計數(shù)5個視野，最終得分=著色強度得分+陽性細胞百分比得分。按下列進行評分：陽性細胞：5%以下計0 分、～25%計1 分、～50%計2 分、～75%以上計3分、＞75%計4分；著色強度：無著色計0分、淺著色計1分、棕黃色計2分、深棕色計3分；陰性≤2分，陽性≥3分；同時記錄每個視野陽性細胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理

使用 SPSS 24.0、GraphdPad Prism 8 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料的比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，3 種蛋白表達的關(guān)聯(lián)性采用Spearman 分析，P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 三種蛋白在胃癌和癌旁組織中的表達情況

HIF-1α、CD68 均表達于細胞質(zhì)，CD206 表達于細胞核和細胞質(zhì)。HIF-1α在胃癌、癌旁中的陽性率分別是58.1%、18.6%（P＜0.05）；CD68 在胃癌、癌旁中的陽性率分別是69.8%、23.3%（P＜0.05）；CD206在胃癌、癌旁中的陽性率分別是51.2%、9.3%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1、表1）。

表1 三種蛋白在胃癌及癌旁組織的表達情況（n）

圖1 HIF-1α、CD68、CD206 在胃癌及癌旁組織中的表達（SP,×200） HIF-1α的表達主要在胃癌細胞，CD68、CD206 主要表達在間質(zhì)細胞

胃癌、癌旁組織中每個視野下CD68+細胞數(shù)分別為（39.7±7.6）、（8.5±2.8）個；CD206 陽性細胞數(shù)分別為（32.0±9.2）、（3.4±1.8）個；HIF-1α+細胞數(shù)（22.9±5.6）、（2.1±1.2）個；以上組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖2、圖3、圖4）。同時，胃癌組織中CD206+細胞數(shù)與HIF-1α+細胞數(shù)表達呈正相關(guān)（P＜0.01，R2=0.641）（圖5）。

圖2 CD68+細胞在胃癌和癌旁組織中的表達 **P＜0.01

圖3 CD206+細胞在胃癌和癌旁組織中的表達 **P＜0.01

圖4 HIF-1α+細胞在胃癌和癌旁組織中的表達 **P＜0.01

2.2 三種蛋白的表達與臨床因素的關(guān)系

三種蛋白在癌組織中的表達與年齡、性別、脈管癌栓無關(guān)（P＞0.05），但與胃癌的病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）（表2）。

3 討 論

圖5 HIF-1α+與CD206+在胃癌組織中表達的相關(guān)性分析

腫瘤微環(huán)境在腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用，導致腫瘤惡性傾向和化療抵抗等行為［3，4］。慢性炎癥有助于癌癥進展，并可能增加不同類型癌癥的易感性［6］。巨噬細胞構(gòu)成了腫瘤微環(huán)境中最主要的炎癥細胞之一，被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM），分為M1 和M2 型巨噬細胞，M1型巨噬細胞分泌iNOS、TNF 等炎癥因子，促進炎癥發(fā)生，防止細菌、病毒、真菌等感染，抑制腫瘤發(fā)展；而M2 型分泌IL-10、TGF-β等抗炎因子，參與組織修復、血管生成、腫瘤進展，還可以抑制免疫細胞活性，誘導機體對腫瘤的免疫耐受［1］。在腫瘤微環(huán)境中，不同的免疫細胞被癌相關(guān)的信號招募且癌細胞和免疫細胞相互影響、促進［7］。

研究證實，腦、胃、乳腺、肝臟、結(jié)腸等癌腫內(nèi)，缺氧影響著患者的生存期［6］。腫瘤缺氧可以通過募集的M2 型TAM 分泌VEGF 等促血管生成因子促進腫瘤新生血管的形成、降解細胞外基質(zhì)，促進癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［9］。此外，在應(yīng)對缺氧時，HIF-1α穩(wěn)定表達并轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)和HIF-1β形成功能化的異源二聚體，繼而激活胃癌血管生成、侵襲、能量代謝、腫瘤生長及不良預后等一系列基因的表達，HIF-1α是組織缺氧主要標志物［10］。HIF-1α與胃切除術(shù)后患者的總生存率和無病生存率密切相關(guān)，HIF-1α的高表達被認為是一種有前途的獨立預后生物標志物［11］。同時，缺氧區(qū)域的TAM 介導了多種腫瘤的治療抵抗，從而促進癌的復發(fā)［12］。

CD68 是一種相對分子質(zhì)量為110 000 的細胞漿糖蛋白，與溶酶體顆粒有關(guān)，主要表達于單核細胞、巨噬細胞，是巨噬細胞最可靠的標志物［13］。文獻報道 CD68+TAM 可以促進前列腺癌［14］、肺癌［15］、腦癌［16］等患者預后。而CD68+TAM 與子宮頸癌［17］、膀胱癌［18］、乳腺癌［19］、胃癌［1］等預后差直接相關(guān)。CD206是M2型巨噬細胞的主要標記物之一，CD206的表達高低及數(shù)量可以反映巨噬細胞浸潤的數(shù)量，與腫瘤惡性程度及預后明顯相關(guān)［20］。

表1 三種蛋白在胃癌及癌旁組織的表達情況

本研究通過免疫組化技術(shù)測定了胃癌和癌旁組織中的CD68、CD206、HIF-1α的表達，發(fā)現(xiàn)均明顯高于癌旁組織，說明胃癌組織存在缺氧狀態(tài)、胃癌細胞可釋放活性因子招募單核細胞往腫瘤微環(huán)境中浸潤并分化為TAM，形成正反饋。同時，三種蛋白在胃癌中的表達與年齡、性別等因素無關(guān)，而與患者的病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。胃癌組織中CD206+細胞數(shù)與HIF-1α+細胞數(shù)表達呈正相關(guān)，說明胃癌缺氧區(qū)域HIF-1α的表達可能對M2 型巨噬細胞有趨化作用或者促進巨噬細胞往M2 型極化，加重惡性循環(huán)，促進胃癌發(fā)生發(fā)展。