miRNA對肝星狀細胞的作用在肝纖維化病程中的影響

劉興遠 白彬

肝纖維化是在多種致病因素作用下引起的肝臟中細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的異常沉積所致的病理過程。而ECM主要由活化的肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)轉(zhuǎn)化而成的肌成纖維樣細胞所分泌的。microRNA (miRNA)是長度約為22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，近些年發(fā)現(xiàn)多種miRNA參與了HSCs的活化、增殖以及凋亡，并在其中起到了重要的調(diào)控作用。因此研究miRNA在HSCs中的作用可以為尋找診斷和評估肝纖維化的指標，以及為研發(fā)治療肝纖維化的的基因靶向治療藥物提供新的靶點和思路。

一、HSCs的概述

HSCs定位于Disse腔內(nèi)，其胞體緊貼肝竇內(nèi)皮細胞和肝細胞。HSCs胞質(zhì)內(nèi)有大量的富含維生素A以及甘油三酯等物質(zhì)的脂滴是其具有特征性的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。HSCs具有視黃醇代謝，肝竇血流調(diào)節(jié)，EPO生成等生理功能，除此之外，作為肌成纖維樣細胞的主要出處，它還在纖維化中起到重要作用[1]。

當受到各種損傷因素的刺激后，靜止狀態(tài)的HSCs被激活，進而分化為肌成纖維樣細胞[2]。目前有文獻報道稱衰老的HSCs相對于增殖狀態(tài)的HSCs的增殖能力和產(chǎn)生膠原蛋白的能力減弱。但是同時也有文獻報道稱由肥胖導(dǎo)致的肝纖維化中，HSCs的衰老和肝纖維化水平無關(guān)[3]在HSCs的衰老對于肝纖維化的影響現(xiàn)在還存在爭議。

二、miRNA對HSCs的調(diào)控

(一)miRNA促進HSCs活化的調(diào)控

1.促進活化

TGF所介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在HSCs的活化過程中起到重要的作用，miRNA作為重要的調(diào)控因子作用于TGF-β信號通路。Xia Xie等[4]通過Gene Expression Omnibus(GEO)篩選出MicroRNA-503，并通過靶基因分析以及相關(guān)信號通路研究發(fā)現(xiàn),MicroRNA-503可以通過SMAD7作用于HSCs。miR-503/SMAD7可以通過TGF-β/SMAD途徑增強HSCs的活化以及纖維化。Xiutao Fu等[5]通 GEO篩選了正常人，輕度肝纖維化以及晚期纖維化肝臟樣本之間差異性表達的miRNA為miR-20a-5p。之后他們在京都基因百科全書(https://www.kegg.jp/ KEGG)中發(fā)現(xiàn)12個目的基因在TGF-β通路中顯著富集。miR-20a-5p在肝纖維化中的下調(diào)導(dǎo)致TGFβRII激活，進而TGF-β信號通路被激活，隨后激活巨噬細胞和肝星狀細胞產(chǎn)生細胞外基質(zhì)。

2.抑制活化

PI3K/AKT/mTOR作為調(diào)節(jié)細胞周期的重要細胞內(nèi)信號通路同細胞的休眠、增殖、癌變和壽命直接相關(guān)。Liang H等[6]利用基因芯片分析，觀察到miR-141是在肝星狀細胞激活過程中上調(diào)最多的miRNA之一。通過功能分析發(fā)現(xiàn)miR-141抑制了靶基因的表達，降低了肝星狀細胞的活性，并且抑制了促纖維化標志物的表達水平。此外miR-141的下調(diào)可以影響AKT/mTOR通路的抑制劑-磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)從而抑制肝星狀細胞的活化。

核激素受體家族中之一的氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)作為配體誘導(dǎo)核受體，調(diào)控多種代謝。Le Tao[7]通過檢測慢性乙型肝炎肝硬化患者的肝臟組織發(fā)現(xiàn)，miR-942作為配體誘導(dǎo)受體之一，可以通過抑制過PPARs的基因表達，阻礙肝星狀細胞活化的發(fā)生。

Notch信號通路在脊椎動物和非脊椎動物大量存在，在進化上高度保守，在相鄰細胞之間發(fā)揮作用，進而調(diào)節(jié)細胞、組織、器官的分化和發(fā)育。Juanjuan Li等[8]建立CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化為體內(nèi)模型以及以轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)處理的HSC細胞系LX-2和HSC-T6為體外模型，發(fā)現(xiàn)，miR-489-3p的過度表達可以降低JAG1(jagged canonical Notch ligand 1)的表達，同時肝纖維化標志物的表達降低，因此得出miR-489-3p的過表達可以通過JAG1/Notch3通路抑制肝星狀細胞的活化。

(二)對HSCs增殖的影響

Wang Z等[9]體內(nèi)外模型中發(fā)現(xiàn)，MiR-203a-p可以直接抑制P66Shc的翻譯，P66Shc的表達下降可以進一步的抑制線粒體中ROS的生成和肝星狀細胞的增殖。Yong-Zhen Wang等[10]報道了，TGF-β1通過下調(diào)miR-454的表達來促進HSC-T6的活化和增殖，從而進一步上調(diào)Wnt10a基因的表達。MiR-454可以通過抑制Wnt10a基因的表達來阻止這一過程，從而抑制肝纖維化。

(三)miRNA對HSCs凋亡的影響

肝纖維化的逆轉(zhuǎn)主要基于HSCs的凋亡。肝細胞凋亡后，金屬蛋白酶抑制劑的合成減少，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化的過程[11]。因此尋找促進HSCs凋亡的miRNA是研發(fā)抗纖維化藥物至關(guān)重要的研究。

Xinjie Hao等[12]報道，經(jīng)過miR-21處理后的LX-2細胞的IL-6, TNF-a,以及TGF-b1水平升高，α-SMA，I型膠原蛋白的表達增高，Bax/B細胞淋巴瘤(Bcl)-2比率和程序性細胞死亡4(programed cell death 4,PDCD4)的表達水平降低。同時PTEN的mRNA和蛋白表達產(chǎn)物減少，PI3K/AKT被促進，這表明通過PTEN/PI3K/AKT通路，miR-21可能抑制肝星狀細胞的增殖并抑制其凋亡。

Xuemin Niu等[13]分析了丙型肝炎病毒誘導(dǎo)的肝硬化患者血清的miRNA的微陣列數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了miR-1273g-3p是上調(diào)最顯著。miR-1273g-3p的表達上調(diào)可使PTEN的翻譯減少，Col1A1、α-SMA的表達增加，從而肝星狀細胞的凋亡減少。

Caspase是可對天冬氨酸殘基后的肽鍵進行特異性切割的蛋白質(zhì)。這一過程可以誘導(dǎo)HSCs凋亡。Jiang Wang等[14]報道了Caspase-9和PARP通過miR-29b抑制PI3K/AKT通路，從而促進HSCs (LX-1, HSC-T6)的凋亡來預(yù)防肝纖維化。Yang Wang[15]報道了在非酒精性脂肪性肝病、活化的HSCs和甲硫氨酸膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的纖維化小鼠模型中miR-130a-3p低表達。實驗誘導(dǎo)miR-130a-3p的表達增加，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-130a-3p的過表達促進HSCs的凋亡。

三、基于miRNA靶向HSCs在肝纖維化中的臨床價值

未經(jīng)治療的肝纖維化最終會導(dǎo)致肝硬化，并增加患HCC的風(fēng)險[16]。在7 000人的隊列中，晚期纖維化的發(fā)生率約為2.8%[17]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)非編碼RNA(non-coding RNA)更加豐富的功能。其中，miRNA因其在基因調(diào)控中的作用而成為藥物開發(fā)的可能靶點。

目前基于miRNA的治療主要包括兩類。第一類是miRNA的抑制，類似于反義療法。用合成的單鏈RNA作為目標miRNA的互補鏈，進而目標抑制內(nèi)源性miRNA的作用。另一類是miRNA的代替療法。用人工合成的miRNA的類似物來模擬內(nèi)源性的miRNA,進而使目標基因降解或者抑制，從而發(fā)揮沉默作用[18]。

miRNA與mRNA的結(jié)合不是完全的互補配對，只是部分性的，因此miRNA可以與多種mRNA結(jié)合發(fā)揮作用[18]。Friedman等[19]基于生物信息學(xué)手段預(yù)測了，超過60%的人類蛋白編碼基因可被miRNA所調(diào)控。因此無論是在尋找肝纖維化的早期具有特異性和敏感性的診斷指標上，還是研發(fā)的抗纖維化的藥物上，miRNA都具有廣闊的前景和價值。

(一)miRNA在診斷中的作用 在肝纖維化的過程中，肝纖維化的程度和進展是衡量診治效果的重要指標。肝活檢是診斷肝纖維化的金標準。然而肝病理學(xué)檢查是一種價格相對高昂的，有多種潛在并發(fā)癥的一種有創(chuàng)操作。肝活檢同時也受到穿刺者的采樣的誤差以及病理醫(yī)生的分期判斷差異而對技術(shù)水平有較高的要求。目前已經(jīng)開發(fā)了各種非侵入性診斷工具，其中一些已經(jīng)進入臨床實踐，包括血清學(xué)評分工具，如肝纖維化指數(shù)評估(ELF)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶/丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST/ALT)比率、纖維化-4 (Fib-4)評分和AST與血小板比率指數(shù)(APRI)，以及一些影像學(xué)工具，如瞬時彈性成像(FibroScan)、剪切波彈性成像(SWE)和聲輻射力脈沖(ARFI)等[20]。但是這些非侵入性的診斷方法由于其早期的敏感性和特異性較差，無法滿足臨床診斷的要求。因此，尋找一種無創(chuàng)且可靠的評估肝纖維化的方式是目前迫切需要的

血清中的miRNA因為其穩(wěn)定性好，簡單可重復(fù)性高，現(xiàn)在已經(jīng)成為包括炎癥、腫瘤在內(nèi)的多種疾病的生物標志[21,22]。miRNA在血清中以RNA結(jié)合蛋白結(jié)合和脂蛋白復(fù)合物結(jié)合兩種方式，形成囊泡，如外泌體。外泌體與其他細胞膜接觸融合后將利用外泌體內(nèi)的脂質(zhì)雙分子層膜來保持miRNA結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，并傳遞到靶細胞內(nèi)完成細胞間的信息交換，從而發(fā)揮對HSCs活化、增殖的調(diào)節(jié)作用。

MicroRNA-122已被鑒定為各種肝損傷的標志物，包括肝炎病毒感染，酒精性和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等。 來自肝細胞的細胞外miR-122可被傳遞至肝星狀細胞HSCs，以調(diào)節(jié)其增殖和基因表達[23]。呂金明等[24]在對多例慢性乙肝，肝硬化以及早期肝癌患者的研究當中，發(fā)現(xiàn)血清miR122單項檢測在肝硬化、肝癌早期診斷中有一定價值,血清miR122聯(lián)合AFP,CEA的診斷效能高于單一指標檢測。

周興蓓[25]對比了經(jīng)過肝穿刺的慢性乙型肝炎患者和正常人的血清中的miRNA，找出了miRNA-34a和miRNA-337，miRNA-34a和miRNA-26a兩組miRNA可能作為區(qū)分正常人和肝硬化患者以及監(jiān)測肝硬化進展的指標。其中第二組miRNA-337的表達降低與肝癌TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

然而，這些差異性表達的miRNA譜通常只是考慮的是促使肝纖維化的單一病理因素。在不同患者群體中識別肝纖維化早期階段的診斷價值仍有待證明。Joeri Lambrech等[26]找出了4個與HSCs相關(guān)的miRNA，Let-7f-5p和miRNA-378a-3p，miRNA-451a, miRNA-142-5p, 建立了miRFIB評分。miRFIB評分與PDGFRβ水平的結(jié)合可以顯著提高在異質(zhì)性肝纖維化患者中的診斷效能。

(二)基于miRNA的治療 在肝纖維化的早期，可以通過適當?shù)闹委煟绶每共《舅幬锘蝻@著的生活方式改變阻止肝纖維化這一過程[27]。盡管有大量文獻報道了控制或者逆轉(zhuǎn)纖維化的理論和方法，但這都是基于動物實驗和體外研究。目前尚且沒有一種被FDA所批準上市的抗晚期肝纖維化的藥物。因此對于尋找能夠抗纖維化乃至逆轉(zhuǎn)肝硬化以及尋找早期發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測肝硬化的指標是刻不容緩的任務(wù)。

Wu[28]合成并組裝pH敏感性納米膠束(T-PBP)負載miRNA-29b和miRNA-122， T-PBP膠束以磁共振成像可見方式有效地將miRNA-29b和miRNA-122轉(zhuǎn)運至小鼠HSCs，通過下調(diào)纖維化相關(guān)基因(包括I型膠原蛋白α)的表達，產(chǎn)生協(xié)同抗纖維化作用。Shanshan Zhu等[29]報道了MiR-29b的過度表達降低了蝦青素(Astaxanthin AST)處理的LX-2細胞中Bcl-2的表達，沉默它具有相反的效果。這表明AST可能是通過調(diào)節(jié)MiR-29b，抑制Bcl-2表達水平和升高Bax和Caspase-3表達水平來促進肝星狀細胞的凋亡。張利芬等[30]通過將miR-484的抑制劑轉(zhuǎn)染至HSC-T6細胞，qPCR提示抑制劑組的Fis1和caspase-3mRNA的表達量提高，而且肝纖維化的標志物降低，這表明miR-484的靶基因為Fis1，肝纖維化的指標降低。此外抑制劑組的細胞48h后細胞凋亡明顯高于空白組以及陰性組,這提示miR-484有促進HSCs凋亡的作用。

四、展望

miRNA作為一種重要的非編碼RNA，可以在HSCs的活化，增殖以及凋亡多個方面進行正向或者負向的調(diào)控，影響基因的表達水平。但是我們應(yīng)當同時看到，盡管miRNA在進化上高度保守，但是大量的文獻報告的miRNA的表達差異譜也不盡相同，這可能是由于種屬差異引起的，可能是各種導(dǎo)致肝纖維化的病因激活HSCs的方式不同所致。由于主要受到病理活檢有創(chuàng)操作的限制，基于人類肝臟組織作為標本作為探尋差異性的文獻報道較少。目前探尋差異性表達的miRNA主要是基于體外模型(如HSC-LX2和HSC-T6)，實驗小鼠以及人類血清的外泌體。外泌體miRNA作為一種新型的信息分子，目前對于其在肝纖維化過程中的基礎(chǔ)機制的研究仍然較少。這些都是應(yīng)當作為肝病學(xué)者今后亟需不斷探尋的問題和方向。