抗衰老和抗纖維化的嵌合抗原受體T細胞

李飛 陸倫根

嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)最早于1989年由Zelig Eshhar提出，他將抗體的輕重鏈與T細胞受體(TCR)的恒定區相連，構建出不依賴主要組織相容性復合物(MHC)的嵌合T細胞受體[1]。基于該原理，他提出具有腫瘤特異性嵌合抗原受體(CAR)的T細胞可用于殺滅腫瘤細胞的設想。經過多年發展，CAR-T技術日臻成熟，且被美國食品藥品管理局(FDA)批準用于治療血液系統惡性腫瘤并取得了極佳的療效[2]，同時有大量研究在探索該療法用于治療實體瘤的可能性[3- 4]。該方法首先需從患者外周血中分離出T細胞，采用基因工程技術進行修飾，使其能夠表達腫瘤特異性嵌合抗原受體，并在體外大量擴增后再回輸至患者體內，腫瘤特異性抗原受體可以特異性識別腫瘤細胞膜表面抗原并激活T細胞對腫瘤細胞實施免疫清除[5]。除此之外，CAR-T細胞還被嘗試用于抗衰老和抗纖維化治療等方面[6]。

細胞衰老又稱為復制性衰老，是指細胞不可逆地喪失增殖能力，進入細胞周期停滯狀態。衰老細胞可以分泌炎癥因子、趨化因子、腫瘤壞死因子、蛋白酶等衰老相關分泌表型(SASP)，這些分子能招募NK細胞和T細胞對衰老細胞進行免疫清除，參與組織重建、創傷愈合、免疫監視等生物學功能，而衰老細胞的聚集可能導致疾病，因此清除衰老細胞有可能用于疾病治療[7]。肝星狀細胞(HSC)在肝臟受損后活化并分泌細胞外基質(ECM),在肝纖維化和肝硬化的形成中發揮核心作用[8]。活化的星狀細胞具有極大的異質性和各自不同的生物學特點。根據其增殖能力和分泌ECM的能力，可將HSC分為具有高增殖能力的HSC、具有較強ECM分泌能力的HSC以及衰老的HSC等三個亞群[9]。研究表明，抑制HSC或清除HSC可減少其通過自分泌、旁分泌對自身和其他細胞的作用，進而抑制肝纖維化的發生和進展[8]。

Amor等[10]研究發現，通過CAR-T可以靶向殺滅衰老的星狀細胞，減輕肝纖維化，改善肝功能。在該實驗中，研究人員通過RNA測序分析MEK聯合CDK4/6抑制劑誘導的衰老肺腺癌細胞、N-ras原癌基因誘導的衰老肝細胞以及體外增殖誘導的衰老小鼠肝星狀細胞的轉錄組，最終篩選出衰老細胞高表達、其他重要組織器官不表達的PLAUR作為衰老特異性基因，該基因編碼尿激酶纖溶酶原激活物受體(uPAR)，該受體表達于細胞膜表面，參與組織重建、傷口愈合以及腫瘤形成等病理生理過程，在與配體結合后酶解為可溶性uPAR(suPAR)作為SASP和衰老相關疾病的血清學標志物[11]。免疫組織化學實驗證實，該受體表達于多種衰老細胞膜表面，包括非小細胞肺癌、胰腺癌以及四氯化碳所致肝纖維化小鼠模型肝臟細胞。此外，該課題組還證實，不同病因所致人肝纖維化組織高表達uPAR，這些uPAR陽性細胞高表達SA-β半乳糖苷酶、p16以及IL-6等衰老相關分子，低表達細胞增殖標志物Ki67；進一步研究表明，部分uPAR陽性細胞共表達星狀細胞標志物desmin。基于以上實驗結果，uPAR被認為是一個具有較高特異性的衰老相關細胞膜蛋白。因此該課題組構建了uPAR特異性小鼠CAR-T細胞，并將其分別注射至四氯化碳或高脂飲食所致肝纖維化小鼠體內，20 d后獲取肝組織樣本，發現給予uPAR特異性CAR-T細胞小鼠肝臟衰老細胞顯著減少，并且肝纖維化程度明顯改善。因此，CAR-T細胞有望成為治療肝纖維化的新方法。

盡管Amor課題組發現uPAR特異性CAR-T細胞能減輕肝纖維化，并改善肝功能，但該治療方案仍有諸多問題需要解決。既往研究表明，衰老的星狀細胞分泌ECM的能力下降，并能分泌ECM降解相關酶；另外衰老的星狀細胞可招募多種免疫細胞，尤其是NK細胞對其進行免疫清除并能降解ECM的沉積，因此衰老的星狀細胞能通過多種機制抑制肝纖維的進展[9,12]。在Amor的研究中，CAR-T細胞清除掉uPAR陽性的衰老星狀細胞，并沒有將具有活躍增殖能力和分泌ECM的活化的星狀細胞殺滅，卻展現出顯著的抗纖維化效果，因此uPAR特異性CAR-T細胞減輕肝纖維化的機制有待進一步研究。uPAR并非衰老的星狀細胞特異性標志物，且活化的星狀細胞亦不同程度表達uPAR，衰老的星狀細胞與活化的星狀細胞存在一定程度重疊，而非完全獨立的兩個亞群。此外，Amor等發現uPAR陽性的星狀細胞表達SA-β半乳糖苷酶和p16等衰老標志物，但并非所有uPAR陽性的星狀細胞均表達衰老標志物，表明并非所有uPAR陽性的星狀細胞都處于衰老狀態。另外，部分uPAR陽性細胞表達巨噬細胞標志物F4/80，表明uPAR特異性CAR-T細胞亦可殺滅巨噬細胞，因此uPAR特異性CAR-T細胞治療肝纖維化的機制有待進一步明確。本研究僅對四氯化碳和脂肪肝所致肝纖維化小鼠模型進行描述，未對其他病因所致人肝纖維化組織uPAR的表達情況進行探索，因此需要進一步研究。在本實驗中，Amor等僅實施了單次CAR-T細胞注射治療，20 d后即獲取小鼠肝臟和血清樣本進行分析，因此無法評估其長期療效和不良反應。另外，其他組織細胞也可低表達uPAR，而作為uPAR特異性CAR-T細胞的靶標，CAR-T細胞對這些細胞的清除是否會產生嚴重不良反應亦有待進一步研究。

綜上所述，衰老的星狀細胞表達膜蛋白uPAR，據此可構建uPAR特異性CAR-T細胞對其進行免疫清除治療肝纖維化和改善肝功能。但該治療方案能否用于肝纖維化治療尚需完成以下工作：明確uPAR在星狀細胞、巨噬細胞中的表達情況，闡明uPAR特異性CAR-T細胞緩解肝纖維化的確切機制；明確uPAR在不同病因所致人肝纖維化中的表達情況，以此判斷uPAR特異性CAR-T細胞是否能廣泛用于各種病因所致肝纖維化的治療；全面評估uPAR特異性CAR-T細胞治療肝纖維化的長期療效以及不良反應。