急性肝衰竭大鼠肝星狀細胞內質網應激調節HGF表達實驗研究

藍遠強 吳發勝 黃麗珍 梁敏

肝細胞內存在大量內質網，內質網應激(ERS)參與急性肝衰竭(ALF)的發生發展[1-3]。肝細胞生長因子(HGF)對ALF發生后肝臟組織細胞的修復再生具有重要意義[4]。有研究認為ERS可能通過影響HGF延緩ALF，但尚缺乏足夠證據[5]，目前臨床有關ALF患者ERS與肝星狀細胞HGF關系的報道也較為罕見。本研究通過大鼠模型基礎實驗，探討ERS與HGF的關系及其相互作用的具體機制。

資料與方法

一、實驗試劑

SD大鼠鼠齡3～4 w，體質量為180～240 g。脂多糖(LPS，貨號Sigma L2880)和衣霉素(貨號MS0013-1MG)均由上海懋康生物科技有限公司提供。D-氨基半乳糖(D-GaIN)由湖北賽搏醫藥化學品有限公司提供，4-苯基丁酸鈉(4-PBA)由美國Sigma公司提供。

二、ALF建模

常規喂養SD大鼠1 w。完成后將60只大鼠隨機分為A、B、C三組，每組20只。先通過腹腔注射給予D-氨基半乳糖 400 mg/kg、脂多糖 20 μg/kg。在注射完成1 h后給予A、C組大鼠0.6 mL/kg衣霉素，C組在完成上述操作后再注射4-PBA 500 mg/kg。在注射脂多糖后0 h(T1)、2 h(T2)、8 h(T3)和12 h(T4)時，各組分別處死5只動物，留取尾靜脈血，離心取上清，備用。

三、檢測方法

采用ELISA法檢測血清HGF，試劑盒由南京卡米洛生物工程有限公司提供；檢測肝組織HGF mRNA(武漢優博生物技術有限公司)。引物設計見表1。

表1 引物序列

四、RNA慢性病毒載體構建

設計并合成eIF2α-shRNA，另以NC-shRNA為陰性對照，序列分別為5′-GTACAAGAGACCTG-GATAT-3′和5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。兩組分別記為eIF2α敲除組和陰性對照組。采用GV248載體，依次進行連接、轉化、鑒定及共轉染處理，完成后8 h替換為完全培養基，常規條件下繼續培養2 d，收集上清液，進行濃縮處理后，再行滴度檢驗。在病毒感染3 d后收集細胞，提取蛋白，行熒光定量聚合酶鏈式反應檢查，收集結果。

五、統計學分析

結 果

一、各組HGF表達

在T1時，三組HGF表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)；在T2、T3和T4時，A組血清HGF水平顯著低于B組和C組，而C組顯著低于B組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組HGF表達(ng/mL)

二、三組HGF mRNA相對表達量比較

在T1時，三組SD大鼠HGF mRNA相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)；在T2、T3及T4時，三組HGF mRNA相對表達量水平差異有統計學意義(P<0.05)。在T2、T3及T4時，A組SD大鼠HGF mRNA顯著低于B、C兩組，C組顯著低于B組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 HGF mRNA相對表達量

三、eIF2α敲除組和陰性對照組HGF mRNA相對表達量比較

ERS時，eIF2α敲除組為0.4±0.2，顯著低于對照組(1.6±0.3，t=7.442，P=0.000)。

討 論

HGF作為肝組織再生調節因子，能加快組織增殖，促進血管生成，已被臨床認可[6]。Hardesty等[7]認為HGF可刺激肝DNA合成。Liu等[8]基礎實驗也證實轉染HGF基因后的肝硬化小鼠肝功能獲得改善，ALF發生率顯著降低。Holman等[9]研究還顯示外源性HGF補充療法可減輕ALF局部炎癥，抑制肝病變進展。而與外源性補充HGF相比，通過轉染增強HGF自分泌能力對促進肝細胞再生可能效果更好。尤其對于ALF患者，可能更有助于保護肝功能，降低病死率，改善預后。

既往報道證實c-Met受體可通過與HGF β鏈內絲氨酸蛋白酶樣結構結合，進而激活蛋白酪氨酸激酶，最終將信號傳至細胞核內，從而促進細胞增殖作用[10]。內質網是具有膜蛋白合成、加工、折疊作用的膜結合細胞器。而ERS多發生于氧化應激、病毒感染等刺激后[11]。阿依西布·薩吾提等[12]報道發現ERS發生后對c-Met受體具有抑制作用。而4-PAB是目前臨床廣泛使用的ERS抑制劑[13]。因而，本研究采用ALF大鼠模型，給予A、C兩組衣霉素干預，誘導ERS發生，并給予C組ERS抑制劑4-PAB作為對照觀察，結果顯示A、C兩組T2、T3及T4時HGF低于B組，而A組血清HGF和HGF mRNA相對表達量低于C組，提示ERS抑制劑干預有助于抑制HGF的下降趨勢。因而，ERS對肝星狀細胞HGF具有調控作用，進而參與病理進程。

eIF2α是由端結構域、螺旋結構域及α-β結構域組成的翻譯起始因子，在蛋白激酶樣內質網激酶通路發揮生物學作用中起關鍵作用[14]。研究還發現eIF2α磷酸化過程可激活轉錄因子4和未折疊蛋白反應相關基因轉錄，降低內質網內未折疊蛋白堆積，進而改善細胞內環境[15]。因此，eIF2α也被認為是ERS的標記。本研究也顯示三組eIF2α蛋白相對表達量在T2、T3及T4各時點表達水平存在顯著差異，說明eIF2α可能與ERS調控HGF過程有關。為此，本研究采用對照實驗方法，通過重組慢病毒轉染細胞，構建敲除eIF2α mRNA后的肝星狀細胞，通過RT-PCR檢查結果顯示兩組HGF mRNA水平差異顯著，說明ERS可能通過影響eIF2α表達調控HGF水平，這可為今后ALF治療提供新的靶向研究方向。

綜上，ERS可通過影響HGF表達，參與ALF病理進程。