纖溶酶的發掘及應用研究進展*

蔣維春 綜述，張羽平 審校

江西省景德鎮市第二人民醫院輸血科，江西景德鎮 333000

近年由血栓引起的疾病逐漸增多，其主要的危害是導致器官內局部堵塞，從而導致機體缺血、缺氧，甚至死亡[1]。治療血栓性疾病首選的是抗凝血類藥物、抗血小板類藥物和溶栓類藥物等[2]。抗凝血類藥物主要分為肝素及其相關制劑、抗凝血酶藥物和其他抗凝血藥[3]。抗凝血類藥物在臨床上運用多年，但其導致機體血小板減少、出血、不能抑制凝血酶等不良反應[4]。以血小板代謝酶類抑制劑、凝血酶抑制劑等為主的抗血小板類藥物適于血小板功能亢進患者[5]，但用藥后的胃腸道不良反應等也限制了其在臨床上的應用[6]。溶栓類藥物主要通過溶解血栓中的纖維蛋白從而溶解血栓[7]。按其在臨床中的應用發展可分為：第一代藥物，以來自人體的尿激酶和鏈激酶為代表；第二代藥物，即組織型纖溶酶原激活劑(tPA)、阿尼普酶、重組葡激酶等；第三代藥物，是基于前兩代藥物改造而來，如瑞替普酶和蘭替普酶等[8]。這些藥物經過改進仍存在一定的缺陷，如出血風險高、價格昂貴、不良反應明顯、來源緊缺等[9]。因此，尋找經濟、安全和高效的天然溶栓藥物就顯得尤為重要。纖溶酶是一類能夠溶解血栓主要成分(纖維蛋白)的一類蛋白酶，是主要的溶栓類藥物[2]。近年來，人們不斷從自然界各種生物中尋找和改進各種纖溶酶，并且有些已經投入市場。目前，從動物、植物和微生物中已發現和純化出了諸多纖溶酶，并對其作用機制進行了研究。

1 纖溶酶的發掘

1.1源自動物的纖溶酶 動物是重要的溶栓藥物來源,除了早期人們從水蛭、蛇和蚯蚓中分離得到具有溶栓效果的纖溶酶外，人們還從蛤、美洲大蠊和中華圓田螺等其他動物中不斷發現新的具有溶栓效果的纖溶酶[10-15]。

JIANG等[10]從水蛭中分離到一種相對分子質量約為27×103的纖溶酶WPI01，該蛋白N端的8個氨基酸為VVGGVEAR，活性蛋白耐受的最高溫度為40 ℃，pH值在6～10時對活性影響較小，在500 U/mL水平下其溶解血塊的效果好于1 000 U/mL的尿激酶。WU等[12]從威廉環毛蚓發現了纖溶酶DPf3，DPf3對纖維蛋白原和血凝塊具有明顯的直接水解能力，對纖溶酶原有微弱的活化活性，被認為具有抗血栓形成能力。DPf3可明顯延長活化部分凝血活酶時間，降低纖維蛋白原水平，說明DPf3通過其固有和(或)共同途徑發揮抗血栓活性，并在凝血第3期發揮抗血栓活性[12]。DU等[13]在西施舌中分離純化出相對分子質量約為30.99×103的纖溶酶，該蛋白具有較強的抗凝血和纖溶活性。PENG等[14]從美洲大蠊中分離純化到纖溶酶，測得其最適溫度為35 ℃，最適pH值為9.0，該酶對癌細胞的生長有一定的抑制作用。ZHAO等[15]從中華圓田螺中分離到一種纖溶酶，該活性蛋白最適溫度為58 ℃；當pH值為7～10時，對該酶的影響較小。

1.2源自微生物的纖溶酶 許多微生物均含有纖溶酶，除早期發現的來自溶血鏈霉菌的鏈激酶和金黃色葡萄球菌的葡激酶外，近年來研究人員又相繼從細菌、真菌及微生物發酵后食品中篩選到具有纖溶活性的物質[16-18]。

YANG等[16]發現來自芽孢桿菌中一種相對分子質量約為34×103的胞內堿性絲氨酸蛋白酶ISP-SW5，其最適pH值和溫度分別為8.0、40 ℃，能夠被苯甲基磺酰氟和乙二胺四乙酸抑制酶激活，但Ca2+和Zn2+能夠增強其活性。MESHRAM等[17]對來自內生真菌的纖溶酶研究發現，在體外該酶相對分子質量約為33×103，能切割纖維蛋白的α和β支鏈，不能切割γ支鏈。KIM等[18]在韓國傳統發酵食品腌魚中發現2種纖溶酶JP-Ⅰ和JP-Ⅱ，2種酶相對分子質量均約為36×103，JP-Ⅰ最適溫度為50 ℃，最適pH值為8.1，而JP-Ⅱ的最適溫度和最適pH值分別為45 ℃和9.9，兩者均具有金屬蛋白酶的性質。

1.3來自植物的纖溶酶 DEA等[19]發現通過口服來自甜瓜的纖溶酶能夠抑制膠原腎上腺素所導致的大鼠血管血栓形成。GOGOI等[20]從腺茉莉的葉子中分離到相對分子質量為30×103的纖溶酶，該蛋白能降解纖維蛋白的α和β支鏈。ZHOU等[21]從傳統的中藥材南蛇藤的果實中發現了一種纖溶酶NST-50，具有抗凝血、抗血小板活化和抗纖溶等活性。

2 纖溶酶與疾病的關系

纖溶酶最初被認為其主要功能是抗凝血，但越來越多的研究發現，纖溶酶與多種病理有著密切關系。梁彥等[22]發現青少年肥胖患者血清尿激酶型纖溶酶原激活物受體水平明顯升高，暗示該受體與肥胖相關的疾病有一定關系。倪萍等[23]發現在冠心病患者中其體內纖溶抑制劑抗原水平及活性水平高于健康者，而酶原水平則低于健康者。纖溶酶與癌癥進展之間的關系也逐漸被關注，血漿激肽酶和高分子量激肽原參與了癌細胞或免疫細胞表面的纖維蛋白溶解過程[24]。纖溶酶的促癌功能主要包括以下幾個方面：(1)釋放與癌癥相關的生長因子[25]；(2)降解促凋亡因子[26]；(3)通過自身或激活促癌因子，從而促進血管生成[27]。

另外，纖溶酶相關因子在炎癥進展的多個方面也發揮重要作用[28]。尿激酶纖溶酶原激活劑及其受體在巨噬細胞、白細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞等免疫細胞外滲過程中起關鍵作用[29]，如血管內皮表面的尿激酶纖溶酶原激活劑及其受體調節白細胞對內皮壁的黏附[30]。使用鏈激酶或重組tPA均可引起急性心肌梗死患者補體通路的激活[31]。除了在炎癥進程中發揮作用外，纖溶酶也被報道在炎癥解決過程中調節一些關鍵步驟，如巨噬細胞的重編程[32]。

3 纖溶酶的臨床應用

纖溶酶作為主要的溶栓藥物，既能直接溶解血栓中的纖維蛋白，又能對纖維蛋白原有一定的作用，因此在臨床血栓相關的多種疾病(急性腦梗死、腦內血腫、進展性腦卒中、創傷性下肢深靜脈血栓等)的治療中被廣泛使用[7]，且安全性和療效均較好。目前臨床上最常用的溶栓藥物是組織型纖溶酶原激活劑，與第一代纖溶酶相比，組織型纖溶酶原激活劑可特異性溶解血栓纖維蛋白[8]。纖維酶的特異性與蛋白質分子內結構域的組織直接相關。非特異性溶栓劑，如β-溶血性鏈球菌鏈激酶會導致血漿纖維蛋白原耗竭和出血[9]。但組織型纖溶酶原激活劑的缺點是前端溶解，大部分組織纖溶酶原激活物結合在血栓纖維凝塊前部。這種結合阻礙了組織型纖溶酶原激活劑進入血栓內部，使得溶解效果下降，并且這種不均勻的溶解模式會導致更小的血塊形成，并從血液中釋放出來可能再次引起血管的閉塞[8]。已有幾種類型的重組組織型纖溶酶原激活劑商業化，包括Alteplase、Reta-plase及Tenecteplase，在臨床上治療深靜脈血栓或肺部栓塞[9]。在急性心肌梗死中使用Alteplase可以降低病死率。與單用阿司匹林和肝素相比，早期病死率(最長4周)降低25%[33]。臨床上使用的重組組織型纖溶酶原激活劑需要的總劑量為每例患者≥90 mg，以達到足夠的溶栓效果。這種高劑量要求主要是由于內源性血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1的抑制，在血栓形成時，血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1會進一步上調，升高的血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1水平使血漿組織型纖溶酶原激活劑失活[34]。

重組組織型纖溶酶原激活劑是唯一獲得美國食品藥品監督管理局批準并被廣泛使用的治療方法，但由于其局限性，只在極少數患者中使用。因此，關于開發效率更高、特異性更強的新型藥物研究呈強勁增長態勢。抗血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1單克隆抗體可降低血栓動物模型中的纖維蛋白沉積，表明抗血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1是一種有效的抗血栓藥物[35]。到目前為止，已經開發出大量的小分子或多肽型血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1抑制劑。Tiplasinin，亦稱PAI-039，是一種小分子血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1抑制劑，被認為結合在血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1的vitronectin區，降低了血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1對組織型纖溶酶原激活劑的抑制，已進行了多個血栓性模型和臨床前研究[35]。

4 小 結

理想的纖溶酶應具有活力高、特異性強、藥效持久、價格低、安全等優點。經過幾十年的發展，纖溶酶的發現和使用從以鏈激酶和尿激酶為代表的第一代，經過纖溶酶原激活劑為代表的第二代和基因工程等生物技術改造的第三代，但依然具有較大的不良反應且價格昂貴。目前，雖然從各種生物中發掘了各種纖溶酶，但對其研究多停留在體外實驗，少有深入研究其在體內的作用機制。因此，借助現代結構生物學、分子生物學、蛋白質和酶工程等生物技術，闡明其機制是將來的研究方向。另外，從應用開發的角度綜合現有纖溶酶優點，運用基因工程等技術設計開發出滿足臨床需求的纖溶酶也是纖溶酶開發應用的重點。