甲狀腺過氧化物酶基因高頻突變c.2268insT的家系報道及文獻復習*

楊 柳,戚小艷，施依彤，馬紹剛

1.江蘇省宿遷市第一人民醫院檢驗科，江蘇宿遷 223800；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院內分泌科，廣西南寧 530023

常見的亞臨床甲狀腺功能減退癥(簡稱甲減)患者血清促甲狀腺激素(TSH)水平升高，并伴有甲狀腺特異性抗體升高。而特發性亞臨床甲減是指甲狀腺特異性抗體[抗甲狀腺過氧化物酶(TPO)抗體(TPOAb)、抗甲狀腺球蛋白(Tg)抗體(TGAb)、抗甲狀腺素受體抗體(TRAb)等]均陰性，TSH升高的一類亞臨床甲狀腺疾病[1]，往往病因不詳。特發性亞臨床甲減患者無明顯臨床表現，多在體檢中發現，是否給予左旋甲狀腺素治療尚存爭議，具體機制尚不明，可能與基因突變有關。長期高水平TSH刺激可導致甲狀腺腫大、甲狀腺結節、高脂血癥、動脈粥樣硬化風險[2-3]。妊娠期伴TSH水平升高，應給予治療[4-5]。

甲狀腺激素合成障礙多與基因突變有關，其中較為常見的是TPO、Tg、雙氧化酶2(DUOX2)、雙氧化酶成熟因子2(DUOXA2)、鈉/碘協同轉運體(NZS)、Pendrin等基因[6]。上述基因的雜合子可表現為特發性亞臨床甲減，TPO雜合突變相關的亞臨床甲減較為少見。而甲狀腺發育相關基因TSH受體、PAX8、TTF-1、TTF-2雜合突變也可表現為特發性亞臨床甲減[7]。所以特發性亞臨床甲減的臨床表型與基因型并不完全一致。本文對1個特發性亞臨床甲減家系進行遺傳學研究。

1 資料與方法

1.1一般資料 先證者，女，25歲，無明顯臨床癥狀，因體檢發現“TSH水平升高”就診。通過詢問病史、查體，初步判斷先證者為特發性亞臨床甲減，考慮與基因突變有關。先證者甲狀腺功能檢查中TSH水平升高，甲狀腺特異性抗體陰性，彩超檢查顯示甲狀腺未見異常。隨后對先證者進行外顯子組測序。本研究獲得宿遷市第一人民醫院倫理委員會批準，并獲得患者及其家屬的同意。

1.2儀器與試劑 采用瑞士羅氏Cobas E602全自動免疫分析儀及其配套試劑檢測甲狀腺相關激素(電化學發光免疫測定法)；使用AxyPrep血液基因組DNA小量試劑盒(上海晶能生物技術有限公司提供)提取基因組DNA。

1.3方法 DNA提取：分別抽取先證者及其相關親屬(包括先證者的祖父母、父母、兄弟姐妹)外周血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝以備基因檢測，使用AxyPrep血液基因組DNA小量試劑盒(上海晶能生物技術有限公司提供)提取基因組DNA。

外顯子測序：按照上海晶能生物技術有限公司的操作流程，通過構建DNA文庫、捕獲外顯子、簇生成等步驟后，采用Illumina Nova600測序儀進行高通量測序。測序結果與人類參考基因組序列19進行堿基對比，鑒別并標注突變基因。突變基因經 Sanger正反測序證實后進行生物信息學分析。

Sanger測序:對目標突變,用Sanger測序法進行驗證。TPO基因第13位外顯子及其側翼引物序列:5′-GCTCAGTGAGTGACCACAGC-3′，常規PCR擴增外顯子片段，純化后Sanger正向測序分析；TPO基因第13位外顯子及其側翼引物序列:5′-GCTCAGTGAGTGACCACAGC-3′，常規PCR擴增外顯子片段，純化后Sanger反向測序分析。

2 結 果

先證者TPO基因第13外顯子c.2268insT雜合突變。PCR擴增TPO基因第13位外顯子并對PCR產物進行Sanger測序，證實先證者及其家系成員中Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅲ3均存在相同TPO基因c.2268insT雜合突變，符合隱性遺傳規律，其中Ⅱ1、Ⅲ3 TPO基因c.2268insT雜合突變伴有亞臨床甲減，見表1、圖1。

表1 先證者及家系成員的甲狀腺功能檢測結果

注：A為該患者的家系遺傳圖(○表示健康女性；●表示患病女性；□表示健康男性；■表示患病男性)；B為突變型；C為野生型；D為健康人TPO基因測序圖；E為患者克隆基因測序；↗所指為先證者，↑所指為插入T。

3 討 論

TPO與髓過氧化物酶、乳過氧化物酶和嗜酸性粒細胞過氧化物共同屬于含血紅素的人過氧化物酶家族，人的TPO基因位于2號染色體上，編碼933個氨基酸蛋白質[8]，主要在甲狀腺濾泡細胞合成，是合成T4的關鍵酶，直接催化甲狀腺球蛋白中酪氨酸殘基的碘化和偶聯，從而合成T3和T4，TPO基因突變是導致T4合成障礙的重要原因，除了已經發現的純合子和雜合子基因突變外，人群中還存在大量未被發現的突變位點，可能導致某些甲狀腺疾病。

本研究對包括先證者在內共12位直系親屬進行隨訪調查，發現該家系三代成員中4人測序結果顯示TPO基因c.2268insT雜合子突變(比例約33.33%)，該突變為TPO基因的高頻突變，在中國人群中較為常見[9-12]。在既往研究報道中，TPO基因純合或復合雜合突變是導致先天性甲減的重要病因[13-15]，單純雜合突變發生亞臨床甲減較為少見。由此可見亞臨床甲減的臨床表型與基因型并不完全一致。

TPO基因c.2268insT插入性突變使翻譯的氨基酸序列明顯錯誤，影響TPO的正常功能。在蛋白質翻譯階段TPO基因c.2268insT插入性突變導致密碼子移碼變異(翻譯氨基酸序列的密碼子發生移位)，提前出現終止密碼子，合成TPO肽鏈變短，成為截短蛋白,無法發揮蛋白質的正常功能，影響TPO活性。TPO生物活性下降，可引起碘有機化障礙，導致甲狀腺激素合成降低，垂體負反饋性調節使TSH水平升高。長期高水平TSH的刺激，增加了甲狀腺結節發生風險，長期可能會導致甲狀腺癌變[16]，所以對于TPO基因突變的患者定期隨訪是十分必要的。

TPO基因缺陷通常是常染色體隱性遺傳，因此區分遺傳突變性甲狀腺疾病和其他甲狀腺疾病對遺傳咨詢具有重要的臨床意義。在臨床上，常規有關甲狀腺方面的檢查，如血清甲狀腺功能檢測、甲狀腺彩超等并不能起指導性作用。因此，針對這一類的亞臨床甲減，需要基因診斷進行確診。本研究存在一定不足，研究樣本量過少，在特發性亞臨床甲減及其家系調查中僅發現4例攜帶突變基因，應擴大樣本量以期發現特發性亞臨床甲減的其他致病基因，亦應進行長期臨床隨訪。

綜上所述，本研究認為TPO基因c.2268insT突變為該家系成員的致病原因。