外泌體在膠質瘤微環境中的研究進展與應用

劉小柳，吳柏燈，張 鑫，曾曉嫚 綜述，鄭 磊△ 審校

1.深圳大學第三附屬醫院醫學檢驗科，廣東深圳 518001；2.南方醫科大學南方醫院檢驗科，廣東廣州 510515；3.廣州三九腦科醫院檢驗科，廣東廣州 510510

中樞神經系統惡性腫瘤在臨床上是預后最差的腫瘤疾病之一，其中惡性膠質母細胞瘤(GBM)是最常見的中樞神經系統腫瘤，發病率約占腦部腫瘤的1/2,臨床上惡性膠質瘤患者的中位生存期只有14～17個月[1]。目前，臨床上GBM的治療手段主要為手術切除、放療和化療等方法，但仍有約2/3的患者在治療10個月內復發，5年生存率僅為5%[2]。GBM是一種高突變率、高異質性、高轉移、高復發的腫瘤，通?；颊叽_診時已處于中晚期，此外由于血腦屏障、手術造成大腦創傷等原因導致臨床上GBM的治療效果不佳[3]，因此，針對GBM尋找疾病早期的生物標志物具有重要臨床意義。

細胞外囊泡(EVs)是一種由多種細胞分泌的雙層膜性囊泡，內含蛋白質、核酸、脂質等多種生物大分子，可介導細胞間物質/信息傳遞、細胞增殖分化、血管形成、免疫調節等過程，廣泛存在于細胞上清液及多種體液(尿液、唾液、腹水、羊水、母乳、腦脊液、關節液)中，相較于循環腫瘤細胞(CTCs)與循環腫瘤DNA(ctDNA)，EVs具有穩定性高、數量級大、取材方便等特點，有望成為一種新型的疾病診斷標志物[4-6]。EVs主要分為外泌體(補充)、微囊泡和凋亡小體三大類[4]。其中，外泌體是由多囊泡體與細胞膜融合形成，呈杯狀/雙凹碟狀，直徑為30～150 nm，浮力密度為1.11～1.18 g/mL，研究表明這一類小粒徑的EVs被認為與多種疾病(如腫瘤、心血管疾病、阿爾茨海默病等)有關[5]。

目前，檢測外泌體的相關技術主要包括外泌體的分離富集與鑒定，分離富集方法主要有差速超速離心法、密度梯度超速離心法、免疫分離法、聚合沉淀法、切向流超濾法、尺寸排阻色譜法和微流控芯片分離法等[7]。差速超速離心法是提取EVs的“金標準”[6]，微流控技術憑借其所需樣品量小，分離和檢測集成化，靈敏度高等優勢開始被臨床使用。外泌體的鑒定包括通過掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡及隨機光學重構顯微鏡等對其形態學表征進行鑒定；利用納米粒子追蹤分析與動態光散射對其濃度/徑粒進行實時分析[7]；利用免疫蛋白印跡法對其特異性蛋白分子進行鑒定；利用拓撲技術對其累加組分進行鑒定[8]。

腫瘤干細胞(CSCs)是腫瘤中具有自我更新和異質性分化能力的細胞亞群[9]，在腫瘤發生、發展及治療后復發中扮演重要角色。CSCs功能的執行依賴其周圍微環境的信號刺激，CSCs微環境的破壞可損傷其自我更新功能，從而抑制腫瘤的生長，CSCs的存在是膠質瘤復發的主要原因；外泌體及其內包含的生物信號分子，被認為是GSCs與腫瘤微環境間的“信息通訊使者”，是重要的生物標志物和治療載體[10-12]。因此，探討外泌體在CSCs微環境中信息交流的作用，以及其產生的生物學后果對神經膠質瘤診斷與治療至關重要。本文將對外泌體在膠質瘤微環境中的作用和在腫瘤發生發展中的研究進展進行簡要綜述。

1 外泌體在膠質瘤微環境中的作用

膠質瘤微環境是由腫瘤細胞、血管周細胞、細胞外基質、固有免疫細胞(小膠質細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞和肥大細胞)、T淋巴細胞、神經元細胞、星形膠質細胞等多種類型細胞組成的。其中膠質瘤細胞來源的外泌體可以“馴化”其他鄰居細胞，誘導其自身特性發生改變，從而促進腫瘤細胞的生長[10]。GBM與周圍的非癌細胞相互作用，以維持有利于腫瘤增殖、腫瘤侵襲、血管生成、免疫抑制及腫瘤耐藥的微環境，涉及多種通信模式，例如可溶性因子，間隙連接通信。

由腫瘤細胞外泌體攜帶和釋放的生物分子不但包括可溶性蛋白，還包括可改變受體細胞中基因表達的多種編碼和非編碼RNA[11]，蛋白質和miRNA可以誘導受體細胞表型修飾和細胞外基質重塑[12]，從而在腫瘤細胞的生長中發揮作用。

1.1外泌體與細胞外基質 膠質瘤的形成和侵襲遷移的主要生物學過程與細胞外基質重塑有關[13]。細胞外基質是一種高度動態的結構，其重塑受融合素樣金屬蛋白酶(MMP)與基質MMP的調節，后者有助于基底膜的降解并通過細胞內骨架重排，致使細胞外基質降解、重塑，MMP表達變化與膠質瘤組織病理學分級相關[14]。據研究顯示，由膠質瘤細胞產生的EVs含有MMP-2明膠酶、pro-MMP-9和基質金屬蛋白酶組織抑制因子1和基質金屬蛋白酶組織抑制因子2，具有促進血管生成的作用[15-20]。

1.2外泌體對單核細胞和巨噬細胞的影響 浸潤性單核細胞是GBM微環境中是最普遍的細胞類型，也被稱為腫瘤相關巨噬細胞[15]，GBM引起的血腦屏障破壞導致單核細胞浸潤，隨后可分化為巨噬細胞，在膠質母細胞瘤的炎性反應中，巨噬細胞所占比例為20%，分為M1和M2 2種表型[21]，具有經典M1表型的巨噬細胞具有吞噬、促進抗原表達和促炎作用，M2型則失去其促炎和抗腫瘤作用，具有促進腫瘤侵襲和腫瘤內血管生長的作用，從而使環境有利于腫瘤細胞生長[22]。研究表明，在GBM細胞系U87和GSCs釋放的EVs中分離出的外泌體，主要靶向單核細胞以誘導肌動蛋白細胞骨架的重組和免疫抑制性M2表型，并分泌單核細胞趨化蛋白3、趨化因子CXC基序配體1(CXCL1)，以及程序性死亡配體1(PD-L1)[16]。單核細胞PD-L1的表達可能是癌癥誘導的免疫逃逸的表型改變，PD-L1的存在可與活化T淋巴細胞的程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)結合以抑制T淋巴細胞功能[23-24]，也可參與巨噬細胞的激活，導致巨噬細胞在異常條件下的過度增殖[25]。

1.3外泌體對星形膠質細胞的影響 星形膠質細胞作為大腦中固有的先天免疫細胞，可有助于防御病原體的刺激[26]，腫瘤周圍的星形膠質細胞可促進GBM的進展。有研究表明，由GBM釋放的EVs可驅動星形膠質細胞的腫瘤支持作用，源于患者的GBM的EVs培養的星形膠質細胞可促進腫瘤生長，同時表皮成長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、集落刺激因子(CSF)、成纖維細胞生長因子、肝細胞生長因子，趨化因子(CXCL1、CXCL19、CXCL110、CXCL111)、趨化因子CC基序配體、MMP9、可以誘導免疫抑制的細胞因子(CSF-2、CSF-3)、白細胞介素(IL)-4、IL-10和IL-13等在體內也可促進GBM的入侵和擴增[27-28]。研究表明GBM的EVs可以修飾周邊星形膠質細胞以誘導腫瘤支持功能，還可以驅動星形膠質細胞發生惡性轉化從而致癌[27-28]。

1.4外泌體對GBM干細胞的影響 KIM等[19]指出間充質干細胞對多種惡性腫瘤生長具有明顯的抑制作用。經間充質干細胞移植后，可趨向腦內膠質瘤部位，進而通過旁分泌MSC-EVs等因子來調節腫瘤細胞微環境，從而抑制腫瘤細胞增殖并誘導細胞凋亡。直接MSC-EVS靜脈注射可以代替間充質干細胞移植，對膠質瘤起到抑制生長的作用。

GBM包含類似于間充質干細胞的基質細胞，其通過依賴于IL-6分泌的機制參與了GSCs致瘤性，FIGUEROA[20]等研究發現手術標本中的GBM間充質干細胞可釋放EVs，通過轉移miR-1587來增加GSC的增殖和克隆性，這反過來又導致腫瘤抑制因子NCOR1(核激素)的表達下降，PALUMBO等[21]證明GSCs釋放了可以誘導GBM細胞成瘤作用的EVs，由GSC釋放的EVs對黏附的GBM細胞系U87MG的細胞生長和遷移具有刺激作用。用細胞黏附分子L1CAM修飾的GSC衍生的EVs也能夠誘導不同類型的GBM細胞系的運動性，增殖和侵襲性。RICKLEFS等[22]證明了由GSCs釋放的EVs保留了腫瘤亞型特征，并且它們在GSC亞型之間的轉移導致靶GSC的致瘤性改變。

GBM相關的人間充質干細胞外泌體中的miR-1587被受體CSCs攝取后通過下調腫瘤抑制基因NCOR1的表達來提高CSCs的致瘤性[23]。綜上所述，外泌體在GSCs微環境中對CSCs與腫瘤細胞動態轉化過程中發揮重要作用，維持GSCs群的穩定，為腫瘤的生存和發展提供有效保障。

1.5外泌體與腫瘤血管生成 周圍血管中氧氣和營養物質的供給有利于腫瘤的生長，腫瘤可以改造其微環境至有利于創建自己的血管系統。其中，CSCs可以通過分泌促血管生成因子如VEGF、SDF-1α、IL-8和CXCR-4來誘導血管的生成[24]，也可通過分泌外泌體被內皮細胞攝取促進新血管生成。在膠質母細胞瘤中，SUN等[25]發現GSCs的外泌體中的miR-21通過激活內皮細胞miR-21/VEGF/VEGFR2信號通路促進血管生成，膠質瘤干細胞來源的外泌體可以提高血管內皮細胞的增殖能力，促進內皮細胞遷移，表明在膠質瘤微環境中膠質干細胞可利用外泌體實現其與血管內皮細胞之間生物學信息的交流。

2 外泌體在腦膠質瘤診斷和治療中的應用

2.1外泌體作為抗腫瘤靶向藥物載體 受治療腦腫瘤藥物在體內的不穩定性和血腦屏障的限制，其療效甚差，研發能夠透過血腦屏障，使藥物可直接靶向作用于原發腫瘤的新型給藥系統將有效提高抗腫瘤藥物的效能。外泌體是人體分泌的膜性囊泡，具有穩定性高、生物相容性好、免疫源性低，血腦屏障透過性好等特性，是藥物靶向投遞的最佳載體，借助超聲波和室溫孵育將紫杉醇組裝于膠質瘤細胞系U87來源的外泌體中，可見載有紫杉醇的外泌體對U87細胞的毒性明顯增加[26]。外泌體miR-34a能夠特異性負向調控膠質母細胞瘤n-Myc基因的表達，鑒于人骨髓間充質干細胞可遷移至腫瘤部位的特性，利用人骨髓間充質干細胞來源的外泌體將過表達的外源性miR-34a遞送至腫瘤細胞，使n-Myc基因沉默，提高膠質母細胞瘤細胞對替莫唑胺的化療敏感性，以達到抑制腫瘤細胞生長的目的，NIE等[27]發現藥物敏感性腫瘤細胞來源的外泌體可逆轉耐藥腫瘤細胞的耐藥性。因此，外泌體除能夠靶向傳遞抗腫瘤藥物、促進其吸收等功能外，還可在逆轉腫瘤細胞耐藥性方面發揮作用，也為外泌體在各種腫瘤的無創診斷、預后判斷及治療中提供新的方法思路[28-29]。

2.2外泌體作為免疫療法的介入靶點 膠質瘤發生發展的主要原因即是其免疫逃避。DOMENIS等[30]針對膠質瘤干細胞外泌體對不同外周免疫細胞群的免疫調節特性進行觀察，發現經膠質瘤干細胞外泌體處理的外周血單核細胞具有抑制T淋巴細胞活化、增殖和輔助性T細胞1(Th1)細胞因子產生的能力，同時不影響細胞活力或抑制T淋巴細胞功能。膠質瘤外泌體主要通過作用于單核細胞，抑制T淋巴細胞的免疫應答，外泌體在選擇性靶向治療膠質瘤時對免疫細胞產生效應，從而減緩或阻止腫瘤進展。而且，膠質母細胞瘤來源的外泌體還可將免疫調節分子轉移到免疫細胞，形成對應的腫瘤免疫微環境[31]。因此，通過抑制外泌體的分泌，改變膠質母細胞瘤組織中的微環境，可能是未來控制其侵襲、遷移的策略之一。

3 結 論

EVs是GBM細胞與腫瘤微環境通訊的重要信號載體，GBM衍生的EVs可被腫瘤環境的不同組成部分例如TAMs，內皮細胞，星形膠質細胞和GSCs吸收，從而參與腫瘤生長、腫瘤侵襲、新血管生成、腫瘤轉化、腫瘤耐藥和免疫應答調節等。來自腫瘤周圍的細胞也釋放出針對GBM的EVs，參與GBM的進展，未來治療策略可能旨在阻斷GBM細胞與基質間質之間建立的這種EVs介導的信息交流。綜上所述，EVs具有傳遞信號分子、調節細胞及周圍微環境的作用，作為疾病標志物，在疾病“液體活檢”中具有巨大的前景，不僅可以作為監測腫瘤復發、預測患者預后的生物學標志物，還有望成為攜帶靶向藥物的載體。