免疫檢查點抑制劑相關生物標志物的研究及臨床應用*

陳彥青，曹 炬

重慶醫科大學附屬第一醫院醫學檢驗科,重慶 400016

隨著2011年美國食品及藥物管理局(FDA)批準的首個免疫檢查點抑制劑(ICIs)Ipilimumab的上市，醫學界開啟了ICIs用于臨床抗腫瘤治療的新紀元，是腫瘤免疫治療的革命性里程碑。免疫檢查點指免疫細胞在維持免疫耐受過程中為調節和控制免疫應答的持久性而具有的一系列抑制通路[1]。而腫瘤細胞又恰好可以通過激活免疫檢查點通路抑制抗腫瘤免疫應答[2]。因此，ICIs主要通過抑制T細胞介導的這種抑制性免疫應答，促進免疫介導的腫瘤細胞清除。目前，ICIs主要分為兩類：一類是靶向細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA-4)的抗體；另一類是靶向程序性細胞死亡蛋白-1(PD-1)及其配體程序性死亡受體配體-1(PD-L1)的抗體。盡管ICIs療法可以為一部分患者提供持久的治療效果，但一部分患者會發生耐藥，還有一部分患者會出現自身免疫樣毒性，也就是免疫相關不良事件(irAEs)。耐藥可以分為兩大類：一類是原發性耐藥，患者對ICIs沒有任何反應并且腫瘤進展迅速；另一類是獲得性耐藥，患者最初對ICIs治療有反應，但最終出現臨床和/或放射學上的疾病進展[3]。而irAEs可以發生在皮膚、甲狀腺、胃腸道、肝、肺等任何器官，根據惡性腫瘤的類別、ICIs的種類和易感性而存在個體差異[4-9]，嚴重者會出現腫瘤暴發性進展甚至死亡。ICIs相關生物標志物的研究可以避免上述耐藥、不良反應的發生，幫助臨床實現個體化精準治療，選擇合適的方法進行治療，延緩患者疾病的進展，提高患者的療效，減少不必要的經濟負擔，早期識別不良反應，避免不良反應的發生，延長患者的生存期。因此，尋找能夠判斷ICIs療效、耐藥，預測和診斷irAEs的生物標志物亟不可待。

1 ICIs及其相關反應的機制

1.1ICIs的作用機制 CTLA-4通路與PD-1通路有許多相似之處，兩者都在活化的T細胞中有表達，均是B7/CD28共刺激受體家族的成員，且均能抑制T細胞增殖、葡萄糖代謝、細胞因子表達和T細胞存活[10]。但兩者也有許多不同之處，其反應時間、反應場所、具體表達細胞、配體表達細胞及具體作用機制均有不同，具體如下。

1.1.1CTLA-4類抗體的作用機制 首個被美國FDA批準上市的ICIs Ipilimumab就是靶向CTLA-4的抗體，主要用于黑色素瘤的治療[11-12]。CTLA-4，又名CD152，僅由T細胞表達。在靜止的T細胞中，CTLA-4是一種胞內蛋白，當主要組織相容性復合物(MHCs)與T細胞受體(TCRs)結合，共刺激受體CD28與配體CD80(B7.1)和CD86(B7.2)結合后，CTLA-4轉移到細胞表面，競爭性地與共刺激因子CD80/CD86結合，介導抑制性信號進入T細胞，從而阻止T細胞增殖和活化。與CD28相比，CTLA-4與CD80/86配體的親和力更高[13]。因此，CTLA-4可以在淋巴結免疫應答的早期控制T細胞的增殖和活化。不同于效應T細胞(Teff)，調節性T細胞(Treg)構成性表達CLTA-4[14]，在炎性反應刺激下，抗原提呈細胞(APCs)上調CD80/CD86的表達，減弱Treg表面CTLA-4對CD28的競爭性抑制，從而激活共刺激信號，促進T細胞增殖，增強炎癥免疫應答。而在腫瘤微環境(TME)中，CD80/CD86受Treg的控制，大量的Treg抑制免疫應答。而CTLA-4抗體具有比CD80/CD86更高的CTLA-4親和力，其與CTLA-4結合可使Treg耗竭或功能性阻斷。CTLA-4抗體還可以防止APCs跨內吞作用，增加其表面CD80/CD86的表達，并通過表達FcR-Ⅳ腫瘤內巨噬細胞介導的直接Treg毒性和抗體依賴性細胞毒性，增強T細胞活化和抗腫瘤免疫應答[15-16]。

1.1.2PD-1/PD-L1類抗體的作用機制 PD-1在活化的T細胞、B細胞和自然殺傷(NK)細胞上均有表達，并且是外周組織后期抗腫瘤免疫的重要組成之一[17-18]。PD-1，又名CD274，是B7/CD28共刺激受體家族中的成員，通過與配體PD-L1和PD-L2結合來抑制T細胞活化[19]，維持免疫穩態。PD-L1在多種腫瘤細胞中高表達[20]，并且在TME中，宿主樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞、成纖維細胞及T細胞中也表達PD-L1，從而抑制抗腫瘤免疫[21-22]。此外，PD-L1的表達還受JAK2、STAT等基因轉錄信號通路[23-24]，轉錄后和翻譯后修飾[25-26]及外泌體轉運[27]等的調控。用抗體阻斷PD-1受體或其配體PD-L1可重新激活TME中耗竭的免疫細胞并消除癌細胞，增強抗腫瘤免疫活性，還能降低PD-L1驅動的非免疫檢查點功能，減弱DNA損傷反應和修復[28-29]。并且，通過抗體下調APC和DC上的PD-L1表達還可以提高對ICIs聯合療法的反應率[30-31]。

1.2ICIs耐藥的機制 目前，對ICIs耐藥機制的研究依賴于臨床前研究和相關的臨床數據[32]。而由于缺乏對ICIs長期療效和臨床反應相關的臨床、分子、免疫學因素的認識，ICIs治療相關的原發性和獲得性耐藥機制也尚未完全闡明。但已經明確的是，ICIs耐藥往往與抗原加工和呈遞中的體細胞突變，與細胞黏附、血管生成[33]和細胞外基質重塑有關的基因上調[34]，以及一些信號通路的改變有關。其中，原發性耐藥的機制包括抗原突變、腫瘤抗原表達缺失[35]、HLA表達缺失、抗原加工機制改變[36]，以及T細胞功能不全。T細胞功能不全包括與MAPK、PTEN/PI3K[37]、WNT/β-catenin[38]和BRAF[39]等致癌基因信號和組成性PD-L1表達[40]改變有關的遺傳性T細胞抵抗,與干擾素-γ(IFN-γ)信號通路突變有關的T細胞不敏感，由Treg/Teff比例失調引起的T細胞抑制功能失調和腫瘤特異性TCRs缺乏的T細胞缺乏。而目前對繼發性耐藥機制的研究還較少，但類似于原發性耐藥，其機制同樣也包括靶抗原、HLA喪失，干擾素信號改變及T細胞功能喪失。但又不同于原發性耐藥患者中β2-微球蛋白(β2-MG)缺失引起的MHCⅠ類抗原提呈缺失，大多數具有β2-MG突變和蛋白表達缺失的患者仍然對ICIs敏感，不表現為繼發性耐藥，提示雖然原發性耐藥和繼發性耐藥的表型機制相似，但其根本機制有本質區別，有待進一步探索。

1.3irAEs的機制 irAEs的機制尚未完全明確，但可以肯定其機制與其相應藥物的治療機制基本一致。其潛在機制主要包括針對腫瘤和健康組織中抗原的T細胞活性增加，之前存在的自身抗體水平增加以及炎癥細胞因子表達上升。有研究發現，在1例患者的心肌和腫瘤組織中有類似的T細胞克隆[41],提示在正常組織中，針對腫瘤的T細胞與針對相關抗原的T細胞之間存在交叉反應[42]，T細胞抗腫瘤活性增加的同時可能也會攻擊正常的組織細胞，導致細胞介導的組織損傷。同時，ICIs可能重新激活原本處于休眠狀態的自身反應性T細胞，導致T細胞對腫瘤抗原和自身抗原的耐受性下降，自身反應性B細胞活化并最終形成自身抗體，引起irAEs，但目前仍缺乏irAEs患者自身抗體表達差異的前后對照研究。T細胞活化必然會引起炎癥因子表達增加，炎癥因子的級聯放大效應在irAEs的發生、發展中也發揮了重要作用。雖然CTLA-4通路與PD-1/PD-L1通路存在一些相似之處，但其本質不同。因此，其機制也因ICIs種類而各有側重。CTLA-4抗體側重于破壞穩態外周的陰性選擇，促進了新的自我反應性T細胞的發育，而PD-1主要激活轉錄因子，改變耗竭T細胞的表觀基因，導致其重新激活并增加了攻擊自身組織的可能性。并且，CTLA-4抗體可以直接與垂體等正常組織的CTLA-4結合，增強補體介導的細胞毒副作用[43]。特定irAEs可能涉及不同的病理學、生理學機制，需要具體問題具體分析。而遺傳學、免疫系統狀態，以及如宿主微生物組學、腸道菌群等的其他環境因素在irAEs中的作用仍不清楚，還有待進一步了解。

2 ICIs相關生物標志物

2.1評估ICIs療效的生物標志物 ICIs療效與腫瘤基因組學、宿主遺傳學，及免疫微環境(IME)有關的PD-L1表達、淋巴細胞表型、炎癥因子表達等有關。腫瘤種類不同，免疫檢查點的應用不同，ICIs引起的免疫應答也不同。并且ICIs藥物史會影響生物標志物的預測效力，但并不會影響藥物的療效。

腫瘤基因組學的生物標志物主要通過基因突變影響T細胞對腫瘤細胞的識別來評估ICIs的療效。與ICIs療效呈正相關的潛在腫瘤基因組學相關的生物標志物包括腫瘤突變負荷(TMB)、MHCs特異的親和力指數(DAI)、錯配修復缺陷(MMRd)和插入缺失突變。與ICIs療效呈負相關的潛在腫瘤基因組學相關的生物標志物包括CTLA-4抗體耐藥相關的黑色素瘤相關抗原(CRMA)、腫瘤內的異質性(ITH)和體細胞拷貝數(SCNAs)。另外，有研究表明BRAF[44]、PBRM1[45]缺失突變與PD-1抗體療效呈正相關關系，KRAS突變合并LKB1缺陷與PD-1療效呈負相關關系[46]； SERPINB3和SERPINB4突變與CTLA-4抗體療效呈正相關關系[47-48]。

宿主遺傳學相關的生物標志物主要與宿主免疫基因多態性有關，包括HLA-Ⅰ多樣性和FcγR單核苷酸多態性，均與ICIs療效呈正相關關系。HLA-Ⅰ多樣性主要表現在HLAB和HLAC位點：HLAB編碼的MHCs能夠與更多樣化的TCRs結合，HLAC在APCs中的表達高于其他細胞。并且，從TMB和TCRs的角度考慮，HLA-Ⅰ 多樣性也能促進ICIs療效提高。研究表明，在黑色素瘤中，等位基因CD16AV158F編碼的FcγR與IgG免疫球蛋白的親和力增加，與CTLA抗體療效呈正相關關系[49]。

與IME有關的生物標志物包括免疫細胞、細胞因子及PD-L1。免疫細胞包括腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)、CD8+T細胞、CD4+記憶T細胞和骨髓源性抑制細胞(MDSCs)。細胞因子主要是TGF-β，其可以促進CD8+T細胞排斥。而PD-L1作為PD-1/PD-L1抗體的作用靶點，和TMB都是ICIs治療的獨立預測因子。其中，與ICIs療效呈正相關的是TILs、CD8+T細胞、CD4+記憶T細胞和PD-L1。其余與ICIs療效呈負相關關系。

此外，還有一些全身性的生物標志物也與ICIs療效有關，如淋巴細胞計數、單核細胞計數、Treg水平、嗜酸性粒細胞計數、白細胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10表達及乳酸脫氫酶活性等。值得注意的是，MMRd實際上會表現出微衛星不穩定性(MSI)，MSI陽性腫瘤實質是一種特殊的高TMB腫瘤，其會高表達PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3及IDO1。因此，除PD-L1之外，PD-1、CTLA-4、LAG3及IDO1也可能成為與ICIs治療的潛在生物標志物。

2.2ICIs耐藥的生物標志物 由于缺乏MHC Ⅰ類分子，抗原加工和提呈受干擾，上文提到的CRMA，也是CTLA-4抗體治療耐藥的生物標志物。而SCNAs會干擾腫瘤抗原與MHCs的裝配，也是耐藥的生物標志物之一。另外，PTEN失活[37]、IFN-γ信號通路相關的基因突變，以及WNT/β-catenin信號通路也是ICIs耐藥的生物標志物[38]。

2.3預測和診斷irAEs的生物標志物 目前，普遍認為女性、身體機能狀態較差及少肌性肥胖均是irAEs的危險因素。而irAEs診斷主要通過排除其他感染、藥物等原因，依賴常規的實驗室指標、影像學表征及病理學分析確定的終末器官功能障礙。若診斷不足可能會導致不適當的毒性治療的持續及不良反應的加劇；相反，若過度診斷則可能導致不適當的ICIs使用的永久保留或終止，以及不適當的糖皮質激素或其他免疫抑制劑的使用。因此，急需一些生物標志物來早預測、早預防、早診斷、早治療irAEs。

預測和診斷irAEs的潛在生物標志物可分為細胞、內分泌激素、自身免疫抗體、細胞因子及趨化因子、微生物、遺傳及影像學指標幾大類。細胞類包括上文提到的Treg，低基礎Treg水平可能增加ICIs引起的結腸炎發生的風險，而CD4+T細胞則恰恰相反，高基礎水平反而會增加ICIs引起的結腸炎發生的風險，但兩者對于預測irAEs均缺乏特異度，無法將其與預測ICIs療效區分開。還有淋巴細胞計數、中性粒細胞與淋巴細胞比值、嗜酸性粒細胞計數、T細胞多樣性和CD8+T細胞均與irAEs的發生、發展呈正相關關系。前3者雖然便宜、常用，但缺乏靈敏度和特異度；后兩者價格昂貴，且對于irAEs患者個體的提示意義尚不明確，可用性有限。內分泌激素中唯一能預測和診斷irAEs的促甲狀腺激素(TSH)和自身免疫抗體中的抗甲狀腺球蛋白是與ICIs引起的甲狀腺炎呈正相關的生物標志物，且具有特異度。其他的自身免疫抗體類生物標志物還包括GAD65抗體、胰島素抗原-2抗體、鋅轉運體8抗體、胰島素抗體和抗核抗體，前4者是診斷ICIs引起的糖尿病的生物標志物，價格昂貴，可用度有限；后者與irAEs發展有關，但對irAEs患者個體缺乏特異度。

能夠預測和診斷irAEs的細胞因子和趨化因子類的生物標志物有很多，可以獨立應用作為irAEs生物標志物的包括IFN-γ、IL-6、IL-17、瘦素、可溶性CD163和CRP。治療后的IFN-γ低水平提示ICIs引起的肺炎，是其特異性指標。低基礎水平的IL-6提示ICIs引起的結腸炎，而出現irAEs后的IL-6升高提示銀屑病加重。高基礎水平的IL-17提示結腸炎，但其檢測試劑價格昂貴，且受目前臨床細胞因子檢測水平的限制。治療后的瘦素低水平、可溶性CD163高水平及CRP表達上升均提示出現irAEs風險增加。細胞因子中IL-8和可溶性CD25同時低基礎水平提示ICIs引起的結腸炎風險增加，而TNF-α和IFN-α2同時表達升高提示嚴重的irAEs。當趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL19聯用，其低基線水平提示irAEs風險增加；而ICIs治療后趨化因子CXCL9、CXCL10、CCL5和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)均升高提示irAEs風險增加。將G-CSF、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、分型趨化因子、成纖維細胞生長因子-2、IFN-α2、IL-12p70、IL-1a、IL-1b、IL-RA、IL-2和IL-13聯用，進行綜合評分，高基礎水平評分和治療后評分均提示出現irAEs風險增加。

微生物組學方面的標志物包括厚壁菌門糞桿菌屬、擬桿菌和與多胺轉運系統、硫胺素、核黃素、泛酸鹽合成有關的微生物代謝產物，其相關指標的基線水平上升均會增加出現irAEs的風險，而擬桿菌和微生物代謝產物相關指標是提示ICIs引起的結腸炎的特異性指標。遺傳學標志物包括HLA-DR4表型、CD177和癌胚抗原細胞黏附因子1(CEACAM1)，HLA-DR4與ICIs引起的糖尿病有關，治療后的CD177和CEACAM1升高，提示irAEs風險增加。最后是影像學指標胸部CT，其評分升高與ICIs引起的肺炎有關，具有良好的靈敏度和特異度。

3 ICIs相關生物標志物的臨床應用

目前，經過Ⅲ期臨床試驗驗證的生物標志物僅有TMB和PD-L1，雖然它們已是臨床應用ICIs的常規監測指標，但其仍有一些缺陷。在非小細胞肺癌中，帕博利珠單抗的應答率在高水平PD-L1表達的情況下為45%～50%，但在無PD-L1表達的情況下其應答率仍有10%～15%。并且在兩個獨立的CTLA4抗體治療黑色素瘤患者的隊列研究中發現，當SCNAs與TMB聯用時，其對ICIs療效的預測效果優于TMB[50]。可見，將潛在的生物標志物最終應用于臨床還有很長的路要走。

而因功能障礙的終末器官不同，目前用于監測和診斷irAE的常規臨床實驗室檢測方法包括用于腎炎的血清肌酐，用于肝炎的天門冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶和膽紅素，用于心肌炎或肌炎的肌鈣蛋白和肌酸激酶，用于胰腺炎的脂肪酶及用于垂體炎和甲狀腺炎等內分泌疾病的腎上腺皮質營養激素、皮質醇、促黃體生成激素、促卵泡激素、胰島素樣生長因子1、生長激素、TSH和游離甲狀腺素等。但是，它們都無法為有關毒性的病理學、生理學機制提供有意義的見解或預測價值。且癌癥患者治療中常發生的肝腎功能障礙并不是ICIs誘導的宿主免疫增強所特有的。目前，雖然將這些常規的臨床實驗室檢測指標作為一般推薦，但實際上支持這些參數的最佳篩查頻率的證據也是缺乏的，而irAEs的其他生物標志物還處于早期探索階段。

4 總結與展望

目前，ICIs治療已被寫入各種復發性惡性腫瘤和中晚期癌癥的臨床應用指南中，甚至能夠躋身于Ⅰ級推薦。但由于在我國，一些ICIs尚未獲得腫瘤治療的適應證，且相關診斷試劑獲批較晚，目前仍缺乏基于我國人群的相關研究及循證醫學證據。雖然已有研究表明[50]ICIs確實對腫瘤有效且能延長患者的總生存期，但其具體機制尚未完全闡明，對其相關生物標志物的研究也處于早期探索階段。隨著檢測技術的快速發展、相關醫學技術的突飛猛進，相信在不久的將來，ICIs的作用機制將會進一步明確，其相關生物標志物的研究會進一步發展，早日應用到臨床以指導癌癥患者用藥，延長患者生存期，提高患者生活質量。