細胞因子檢測在急性移植物抗宿主病診治中的臨床應用

細胞因子是一組激素樣多肽介體，在介導宿主免疫防御中發揮重要的調節作用。細胞因子可由不同類型的細胞產生，起到細胞間信號傳遞、增強或抑制目標細胞增殖、分化、活化和運動的作用。

造血干細胞移植(HSCT)是治療血液系統疾病的重要手段之一。移植物抗宿主病(GVHD)是移植后的常見并發癥，是引起HSCT后死亡的重要原因。GVHD是指患者在接受造血干細胞移植后，由于供體移植物中的免疫活性細胞T淋巴細胞與體內組織間發生特異性免疫反應，從而導致受體的靶組織或靶器官受損。臨床上GVHD可分為移植后100 d以內及100 d之后的急性GVHD(aGVHD)和慢性GVHD(cGVHD)。研究發現,輔助T淋巴細胞中Th1和Th2亞群所分泌的細胞因子失衡會導致GVHD的發生，從而對該疾病的分層診斷、預后判斷及靶向治療產生影響。因此，對于患者體內特異性細胞因子的檢測分析可能會為GVHD的防治提供線索和思路[1]。

由于GVHD不僅會引起全身性免疫疾病，而且還會影響皮膚、胃腸道和肝臟等的功能。aGVHD引起的不同靶器官受損的臨床癥狀缺乏特異性，需要與感染、藥物等其他原因相鑒別。血清生物學標志物檢查是一種簡便易行的aGVHD診斷和評估的重要手段，其生理學研究也有利于進一步了解aGVHD的發病機制。因此，利用生物標志物，特別是具有特異性的細胞因子在aGVHD的診斷、預后評估及靶向治療方面值得深入探索。目前，關于aGVHD的細胞因子研究相對較多，本文對此進行綜述。

1 細胞因子檢測在aGVHD診斷中的價值

aGVHD按3個靶器官受損程度分為Ⅰ～Ⅳ度。aGVHD首先出現的免疫反應發生在移植后的幾周內，對于重度的aGVHD若能進行早期診斷和干預，會減輕靶器官的損傷，并提高移植成功率。病理活檢是一項有創檢查，雖然作為診斷GVHD的“金標準”，但是臨床上大多數患者無法耐受該項檢查，所以能篩選出早期診斷aGVHD及預測aGVHD發生嚴重程度的生物標志物尤為重要。目前研究集中在具有預測性的生物標志物上，但生物標志物能否替代進行診斷還需臨床研究的不斷佐證，以下幾種細胞因子目前比較受關注。

1.1腫瘤壞死因子α(TNF-α) TNF-α在aGVHD的作用機制是通過一連串的放大效應，激活供體T細胞，引起一系列“細胞因子風暴”，從而對宿主靶組織或靶器官產生直接殺傷毒性，進一步導致機體的損傷。MIR等[2]通過對比aGVHD的患者與移植后未表現aGVHD患者之間的內皮損傷程度并檢測TNF受體1(TNFR1)后發現，從移植后的第7天開始，TNFR1水平能夠預測該并發癥的發生。在發生aGVHD的患者中，若TNFR1持續高表達，可考慮行TNF-α預防性的阻斷治療，以降低重度aGVHD的發生率。同時，研究表明，TNFR1對提示患者是否存在激素耐藥狀態有一定的參考價值[3]。但單獨的TNFR1作為診斷aGVHD的依據尚不足以準確預測疾病的發生，而將其與其他生物標志物組合之后的系統評估可能會增強其作為診斷依據的能力[1]。

1.2白細胞介素2受體(IL-2R) 研究表明，aGVHD的發生是由于預處理引起的腸道黏膜損傷，使脂多糖(LPS)從腸道進入外周并誘發“細胞因子風暴”，造成受者體內產生大量的炎性細胞因子釋放，受者體內的抗原提呈細胞(APC細胞) 激活，并為供者T淋巴細胞的激活提供共刺激信號，進而增強供者T淋巴細胞的免疫反應，形成組織炎癥，最終導致靶器官損傷[4]。由于炎性細胞因子在激活T淋巴細胞中起重要作用，激活的T淋巴細胞表達IL-2R。有研究顯示，IL-2和可溶性IL-2R(sIL-2R)在GVHD的發病機制中均起著核心作用，在移植后出現疾病的患者中，其血液中早期的sIL-2R水平與Ⅱ～Ⅳ級GVHD和移植相關死亡的發生率密切相關[5]。同時，BERGER等[6]研究證明，IL-2R和肝細胞生長因子(HGF)與Ⅱ～Ⅳ級和Ⅲ～Ⅳ級aGVHD發生相關，大多數發展為重度aGVHD的患者在其移植后早期即可顯示出高水平的sIL-2R，表明移植早期sIL-2R水平可以作為aGVHD嚴重程度的預判指標。

1.3腫瘤抑制素2 (ST2) ST2是IL-1 受體家族的新成員，也稱為IL-33受體(IL-33R)，目前其唯一已知的配體是IL-33[7]。而ST2基因通過交替剪接產生2種不同的產物,即膜結合型(mST2)和可溶型(sST2)。mST2主要表達于造血細胞中，特別在Th2介導的疾病(如哮喘)中起重要作用。sST2可作為IL-33的誘騙受體，驅動Th2細胞向Th1細胞變化，這些機制能更加清晰地解釋aGVHD的病理、生理發展過程[8]。有研究發現，ST2可進一步在不同嚴重程度的aGVHD患者中不受其他因素影響而表現出獨特的差異性[7]。因此，MCDONALD等[9]將發生aGVHD的患者，以sST2的不同表達水平分為4組，結果發現，具有較高表達水平的sST2患者和Ⅲ～Ⅳ度aGVHD患者的非復發死亡(NRM)顯著增高，同時，高表達水平的sST2患者NRM也顯著高于低表達水平的sST2患者。VANDER等[8]研究顯示，通過蛋白質組學方法，將高ST2水平鑒定為與難治性aGVHD最相關的生物標志物。所以，sST2可以作為確診重度aGVHD和預測NRM的重要生物標志物。

1.4干細胞生長因子(HGF) HGF最初被鑒定為是一種可促進肝細胞增殖的有絲分裂原。HGF是受體酪氨酸激酶c-met原癌基因產物的配體，是一種多功能生長因子，可影響多種細胞。同時，HGF也具有多種生物學作用，包括促進有絲分裂、抗凋亡、血管生成等[10]。通過對不同嚴重程度的GVHD患者的血清進行分析發現，不僅在發生aGVHD的患者中HGF存在顯著差異，而且血清HGF可預測aGVHD的發病嚴重程度及1年NRM[11]。所以通過對移植后患者HGF水平的連續檢測，可以有效預測患者GVHD的發病嚴重程度，便于進行及時干預。

1.5皮膚源性彈性蛋白酶抑制劑(SKALP) SKALP是由介導GVHD的炎性因子誘導產生的。最早被發現在發炎的表皮過表達。MAHABAL等[12]研究顯示，利用免疫組織化學法檢測技術，通過連續6個月對行HSCT的患者進行診斷分析關于皮膚相關aGVHD的SKALP水平變化后發現，SKALP預測aGVHD的靈敏度和特異度分別為100%和75%。SKALP也是區分皮膚相關aGVHD與其他皮疹疾病(如病毒、藥物等引起)的最優鑒別因子[13]。而且，SKALP在皮膚相關aGVHD患者中的水平會隨著其臨床診斷評分的增加而上升[14]。但也有研究發現，在接受移植后100 d內的相同時間點，對是否有aGVHD表現的患者血清進行分析，其血清中的SKALP水平并未發現顯著差異，該研究認為SKALP是皮膚相關aGVHD的特定生物標志物，因為并非所有aGVHD患者都有皮膚癥狀，并且一些沒有aGVHD的皮疹患者也顯示SKALP高表達[3]。說明SKALP在皮膚相關aGVHD患者血漿中的水平可以較特異地預示患者的嚴重程度。

1.6轉化生長因子β(TGF-β) 研究發現，aGVHD患者血液TGF-β水平有所降低[15]。有研究通過對不同GVHD分級的患者血漿進行分析發現，aGVHD患者TGF-β總水平下降，其中Ⅲ～Ⅳ級aGVHD患者的TGF-β水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ級 aGVHD患者，表明TGF-β可作為aGVHD嚴重程度的參考指標[3]。在患者造血干細胞移植早期，供體T淋巴細胞中的Treg是TGF-β的主要來源，并且能夠以TGF-β依賴性的方式減弱aGVHD的臨床表現。但尚不清楚較低水平的TGF-β是否由aGVHD中調節性T細胞(Treg)的減少引起，因為供體來源的Treg不是TGF-β的唯一來源[15]，所以，一般不將TGF-β作為aGVHD診斷相關的生物標志物使用。

1.7內毒素受體Toll 樣受體4(TLR4) Toll樣受體(TLR)是表達在抗原呈遞細胞(如巨噬細胞、樹突狀細胞)表面的一系列跨膜蛋白。TLR4是內毒素LPS識別多種類型的病原體相關分子模式(PAMPs)或損傷相關分子模式(DAMPs)的生物分子，可誘導核因子κB(NF-κB)信號通路，是T淋巴細胞活化和分化所必需的刺激分子(如促炎性細胞因子TNF-α)，最終可觸發GVHD的發生[16-18]。研究發現，TLR4在不同程度的aGVHD患者中有顯著差異，可作為評價aGVHD嚴重程度的指標[3]。通過對激素耐藥型aGVHD患者和激素敏感型aGVHD患者進行對比研究發現，TLR4也有顯著差異。所以，TLR4作為生物標志物對aGVHD患者的診斷可能具有較大意義。

2 細胞因子檢測在GVHD預后評估中的作用

HSCT是血液腫瘤最有效的治療方法之一，雖然HSCT可以誘導移植物抗腫瘤/白血病(GVT/L)效應，但GVHD是患者整體生存(OS)的不利因素，甚至導致死亡，GVHD是移植患者非復發死亡的重要原因。由于生物標志物在GVHD的診斷中具有重要的參考價值，生物標志物研究也成為評估預后的研究方向之一。

有研究收集492例aGVHD患者，使用競爭風險回歸等統計學方法，將TFNR1、ST2和再生胰島衍生蛋白3α(REG3α)的表達水平模擬分為3種預測分數，發現可以有效預測出不同患者在完全緩解(CR)或部分緩解(PR)情況下對治療的反應、NRM及OS[19]。但其研究的局限為當評分處于極端值時(評分為1或3)，該算法對疾病預后相關評估的可靠性受到限制。

對于上述預后評估算法中涉及的細胞因子，均涉及胃腸道相關癥狀的部分發生機制。其中TNF-α參與機制在上一部分的描述中已有提及，由于移植或預處理等因素介導受體產生促炎因子，其中也包括抗原呈遞細胞(APC)的生成增多，繼而供體T淋巴細胞于宿主APC反應后激活，使得細胞內生化級聯反應增強而導致TNF-α等大量的Th1細胞因子增加。最后這些細胞因子進一步與細胞毒性T淋巴細胞等發生協同作用而對局部組織產生損傷。在這類細胞因子中，TNF-α對胃腸道形成特異性損傷，通過對TNF-α的抑制可以明顯減輕GVHD小鼠模型中胃腸道相關癥狀的嚴重程度。sST2的分泌水平在胃腸道相關癥狀中的表現多與炎癥性腸病的發病水平類似[20]，sST2可以作為IL-33誘騙受體從而阻斷IL-33在其相關疾病中的信號傳導。而Treg在腸道中大量存在，并且可以防止在自身和環境中對炎性反應失調。但在慢性腸道炎癥期間，大量存在的sST2可能通過抑制IL-33參與的信號傳導來抑制Treg的產生，并將進一步減弱對疾病的自身調控作用[21]。

臨床研究發現，參與aGVHD病理、生理變化過程的細胞因子在一定程度上可以反映疾病的預后情況。但是由于樣本量或多因素相關分析的相互干擾，使得單一種類的細胞因子對疾病的診斷或預后評價受到限制。因此，應用細胞因子組合來提高特異度是一種有效的解決方法。采用TFNR1、ST2和REG3α相關的算法作為評分來預測疾病的NRM，不僅可以區分GVHD患者的嚴重程度，還可以預測是否有相關的靶器官損傷[19]。有研究通過對40例接受異源性HSCT治療的患者，分別在表現出aGVHD(n=20)和無aGVHD(n=20)的2組患者血清中比較發現，由SKALP、TLR4、TGF-β和TNFR1組成的評估小組不僅可用于aGVHD診斷及患者臨床表現分級，也可以預測表現出aGVHD的患者在接受激素治療后是否表現為靈敏[19]。未來對于細胞因子等生物標志物的研究，可以聚焦提高診斷的特異度，提前預測疾病的發展、轉歸和指導疾病靶向治療，最終推動精準醫療的發展。

3 細胞因子作為靶點在aGVHD的治療現狀

糖皮質激素是aGVHD的一線治療方案，而糖皮質激素治療失敗后產生激素耐藥型的aGVHD(SR-aGVHD)尚無統一的二線治療方案。在一項GVHD效應相關的多種細胞因子靶向單抗或免疫抑制劑進行aGVHD治療的報道中，緩解率約為60%[22]，表明SR-aGVHD的治療取得了進展。

當患者發生aGVHD時，供體的T淋巴細胞與其體內的抗原呈遞細胞發生特異性結合導致供體的反應性T淋巴細胞被激活并增殖，然后轉移至靶器官和靶組織，同時伴隨著大量的細胞因子釋放從而加重aGVHD的過程。IL-2是Th1細胞因子中的“骨干”，其作用主要包括免疫反應的擴增、T細胞及NK細胞的活化、巨噬細胞TNF-α的分泌和皮膚、胃腸道的損傷。研究發現，使用高劑量IL-2治療的aGVHD小鼠較低劑量治療小鼠的病死率更高。KENNEDY-NASSER等[23]研究發現,如果使用超低計量(10×104/U)IL-2進行治療可明顯增加體內的CD4+CD25+FoxP3+Treg，而不會引起GVHD或使細胞介導的對病毒或白血病抗原的反應能力喪失，而同時擴增的Treg細胞可產生有效的免疫抑制作用，降低供體反應性T淋巴細胞活化引發的aGVHD損傷[24]。作為另外一種Th1細胞因子，IL-10可通過下調IL-2來調節CD4+T淋巴細胞的功能，影響GVHD的發病過程。WEBER等[25]研究發現，IL-10敲除的宿主小鼠的生存時間較對照組更短。在對GVHD進行治療時，已有研究證明使用TNF-α拮抗劑可減弱炎性反應，不會影響植物抗白血病效應[26]。同時，在使用抗TNF-α單克隆抗體英夫利昔單抗時，有研究發現，英夫利昔單抗治療類固醇難治性aGVHD的療效，總體反應率為15%～100%，在胃腸道和皮膚aGVHD中觀察到最高的反應率[27]。所以，SR-aGVHD的患者接受抗TNF-α單克隆抗體治療可以起到不錯的效果[28]。

sST2作為GVHD的預后生物標志物可預測SR-aGVHD的非復發死亡率[8]。RAMADAN等[29]研究發現，使用人源性T淋巴細胞注入經過300 cGy全身照射(TBⅠ)預處理的NSG小鼠模型中，檢測人sST2在血清中的水平。通過使用不同計量的小分子ST2抑制劑(ⅠST2)與使用二甲基亞砜的對照組進行比較，發現除了高水平(40 mg/kg)實驗組及對照組外，低、中水平(5、10 mg/kg)實驗組使用ⅠST2后可降低sST2的水平。并且，GVHD評分可同時降低，存活率顯著提高，可以維持移植物抗白血病效應。同時，該研究小組在另一項研究中也發現，在建立aGVHD的小鼠模型中，對比只接受輻射或接受同源T淋巴細胞的對照組，其血清sST2水平與人類患者相似[20]。他們使用了針對鼠類ST2(抗ST2單抗,CNT03914)和適當的對照同種型Ab(ⅠgG)的單克隆抗體同時對建立aGVHD的小鼠模型進行治療，發現在抗ST2 單抗治療的小鼠中，小腸、大腸和肝臟(主要aGVHD靶器官)的組織病理學評分均顯著改善，同時其存活率也顯著提高。

通過將轉染了人類HGF cDNA的HVJ脂質體(HGF-HVJ脂質體)反復注入出現aGVHD的小鼠模型，HGF基因表達后，aGVHD的表現可受到抑制。通常認為，HGF對于預防腸道GVHD發揮重要作用，主要通過以下機制來影響aGVHD的進展：IL-2作為誘導GVHD中Th1相關的關鍵細胞因子，在移植期間阻斷IL-12的產生，降低供體移植物的排異反應。而最初來自于供體的同種反應性T淋巴細胞會誘導胃腸道上皮的損傷，這將引發腸腔的內毒素進入黏膜和黏膜下層組織并進入全身循環。釋放入血的內毒素將進一步激活巨噬細胞分泌IL-12，進而刺激T淋巴細胞產生γ干擾素。同時，γ干擾素也使受到內毒素刺激的巨噬細胞產生更多的IL-12。而研究表明， HGF通過抑制GVHD小鼠IL-12水平發揮對腸上皮細胞的抗凋亡作用來防止胃腸道aGVHD損傷[30]。

4 展 望

細胞因子作為特異性生物標志物已經被應用于aGVHD的診斷、預后評估及靶向治療。因其檢測便利性和技術手段不斷提升，可以利用細胞因子的優勢來彌補傳統方法診斷的滯后性，減少誤診、漏診率。但是，也應該看到，細胞因子檢測在aGVHD上還需要提升其特異度和靈敏度，與感染等疾病進行有效鑒別；尋找更加簡便易行的細胞因子組合等。同時，由于統計學手段的提升，可以很大程度地推進現階段對疾病診療模式的探索，在疾病發展的早期進行診斷，通過提前干預減緩或終止疾病的進展，從而減輕因疾病帶來的損傷。細胞因子作為具有前景的研究方向，值得在aGVHD領域進一步深入研究。