1例危重癥新型冠狀病毒肺炎合并感染馬爾尼菲籃狀菌的檢驗數據動態分析

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是一種直徑為60～140 nm的β屬冠狀病毒，病毒顆粒有包膜，呈圓形、橢圓形，以呼吸道飛沫、密切接觸和氣溶膠為主要傳播途徑[1-2]。由其引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)臨床主要表現為發熱、咳嗽、乏力等呼吸道感染癥狀，嚴重時可迅速發展為急性呼吸窘迫綜合征。馬爾尼菲籃狀菌屬于青霉菌屬，易感于免疫功能缺陷或免疫功能抑制的患者，多發于艾滋病患者,并發于其他疾病較少，馬爾尼菲籃狀菌感染后其臨床表現與COVID-19大致相同且起病隱匿，誤診率高，病死率高[3-4]。本文就2020年2月本院收治的1例危重癥COVID-19患者合并感染馬爾尼菲籃狀菌的檢驗數據進行回顧性分析并報道。

1 資料與方法

1.1一般資料 2020年2月本院收治的1例危重癥COVID-19并發馬爾尼菲籃狀菌感染患者的標本，COVID-19診斷標準符合華人民共和國國家衛生健康委員會制訂的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第五版)》[5]中相關的診斷標準。病例資料：患者，男，72歲，于2020年2月10日因CT檢查兩肺炎癥，SARS-CoV-2核酸陽性，確診COVID-19收治于本院，無基礎疾病史，于2月21日病情加重上人工體外膜肺氧合機(EMCO)；2月29日并發嗜麥芽窄食單胞菌感染，3月12日并發假絲酵母菌感染，5月2日血液檢出馬爾尼菲籃狀菌，期間使用的抗菌藥物包括頭孢曲松/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、美羅培南、替考拉林、萬古霉素、多黏菌素、卡泊芬凈、米泊芬凈等，自5月6日改用兩性霉素B和伏立康唑治療。

1.2方法

1.2.1微生物標本檢驗 血液、膽汁、腹水、胸腔積液抽取標本10 mL注入法國梅里埃血培養瓶；導管尖端、傷口分泌物、中段尿、痰液、肺泡灌洗液，置于無菌容器中，3層包裝并置于貼有生物安全標志箱子立即送檢。生物安全柜中，打開包裝對無菌容器進行75%乙醇消毒。痰標本挑取黏稠標本進行涂片檢查，紫外線照射滅活病毒30 min，置于染片盒里進行革蘭染色法初染后，后拿出生物安全柜進行后續染色。經革蘭染色后若上皮細胞<10個/低倍視野、白細胞>25個/低倍視野為合格標本。

血液、膽汁、腹水、胸腔積液標本使用法國梅里埃血培養儀報陽轉種血平板、麥康凱平板、沙保羅平板，其他標本直接接種沙保羅平板；血平板、麥康凱平板放于37 ℃孵育箱培養，沙保羅平板放于37 ℃和28 ℃孵育箱，經4～5 d培養分離后挑選可疑菌落，進行菌種鑒定及藥敏試驗。

1.2.1.1血清曲霉菌半乳甘露聚糖(GM)檢測 一次性真空管采集患者靜脈血3～5 mL，3 000 r/min離心10 min分離血清備用，采用酶聯免疫夾心法，使用特異性抗體檢測GM，待測樣本指數(I)=待測樣本吸光度(A)值/臨界值質控A值，結果判斷I≥0.50為陽性，I<0.50為陰性。使用β-內酰胺類抗菌藥物，接受清蛋白等血液制品治療及其他真菌感染(如青霉菌)有交叉反應，若有預防霉菌治療則出現假陰性。

1.2.1.2真菌(1-3)-β-D葡聚糖檢測 專用一次性無熱源真空管采集患者靜脈血3～5 mL，3 000 r/min離心10 min分離血清備用，2 h內檢測。真菌(1-3)-β-D葡聚糖特異性激活G因子，進而激活凝固酶原，凝固酶水解反應引起A值變化從而定量真菌(1-3)-β-D葡聚糖水平。結果判斷：<70.00 pg/mL為陰性，70.00～95.00 pg/mL為可疑，>95.00 pg/mL為陽性。

1.2.3超敏C反應蛋白(hs-CRP)和降鈣素(PCT)檢測 一次性真空管采集患者靜脈血3～5 mL，3 000 r/min離心10 min分離血清備用，采用干式熒光免疫法檢測hs-CRP和PCT水平，hs-CRP參考區間為0.00～1.00 mg/L，PCT參考區間為<0.10 ng/mL。

1.2.4結果與解釋 血清GM、真菌(1-3)-β-D葡聚糖、hs-CRP和PCT檢測值均選取數值差異較大的兩點，中間檢測數值差異不大的數值不作顯示。真菌(1-3)-β-D葡聚糖、hs-CRP和PCT聯合升高提示酵母菌感染；血清GM、hs-CRP和PCT聯合升高提示曲霉菌感染，但若結合微生物培養結果可提示馬爾尼菲籃狀菌感染。

1.3儀器 法國梅里埃公司VTIEK MS質譜儀，法國梅里埃公司血培養儀、培養箱，福建艾美益A5000全自動干式熒光免疫分析儀，天津丹娜生物TECAN Sunrise全自動酶免分析儀，TEOMEA2生物安全柜，西安天隆PCR擴增儀。

1.4生物安全防護 檢驗人員采取三級防護措施，穿隔離服，戴N95口罩和雙層橡膠手套，配置負壓獨立房間及外排式A2生物安全柜。標本的接種及涂片，菌種鑒定及上質譜儀前處理、藥敏試驗前處理均在生物安全柜中操作，待靶板干燥10 min后移出生物安全柜上質譜儀，標本培養及藥敏試驗需要一層包裝經75%乙醇消毒后移出生物安全柜放入培養箱培養，在不影響鑒定結果的前提下，所用試劑在上機前必須經過紫外線照射30 min消毒。血清標本3 000 r/min離心10 min后打開離心機蓋前需要靜置10 min,取出真空管打開蓋子后需要靜置10 min才可對標本進行操作，防止產生氣溶膠污染，條件允許可盡量在生物安全柜中配置小型離心機操作。醫療廢物必須按照醫院高危醫療廢物醫療條例進行高壓滅菌處理。

2 結 果

2.1微生物檢查結果 COVID-19并發真菌感染時間表見表1。

表1 COVID-19并發真菌感染時間表

2.2血清GM和真菌(1-3)-β-D葡聚糖檢測結果 GM試驗的檢測結果從3月10日至5月4日，待測樣本指數I一直在0.50以下，結果陰性，至5月10日，待測樣本指數I突然增加到5.00，結果陽性。真菌(1-3)-β-D葡聚糖試驗的檢測結果從3月10日至3月29日，結果均在70.00 pg/mL以上，4月25日起開始下降至70.00 pg/mL，結果之后一直陰性。見圖1。

圖1 血清GM和真菌(1-3)β-D葡聚糖檢測曲線圖

2.3hs-CRP和PCT檢測結果 hs-CRP檢測結果的峰值出現在3月18日和5月4日，分別為200.00 mg/L和139.92 mg/L，檢測低值在4月25日為45.11 mg/L，檢測結果在病情穩定期高于正常范圍的50倍左右，若在病情變化期高于正常范圍的80～200倍。PCT檢測結果的峰值出現在3月18日，為17.22 ng/mL，之后開始回落，直到5月4日出現上升趨勢，從5.29 ng/mL上升到5月10日的6.68 ng/mL，檢測低值在3月29日為1.63 ng/mL。檢測結果在病情穩定期高于正常范圍的20倍左右，若在病情變化期高于正常范圍的40～60倍。見圖2。

圖2 血清hs-CRP和PCT檢測曲線圖

3 討 論

COVID-19是一種高傳染性呼吸道疾病，具有潛伏期長、臨床癥狀多的特征，根據患者感染的病情分為無癥狀感染者、輕癥型、普通型、重型、危重型。據報道，老年人重型COVID-19的發病率和病死率明顯高于其他年齡組[6-8]。老年重型COVID-19由于病情反復危重，使用抗菌藥物治療周期長，免疫功能低下，常采用長期導管治療并不間斷侵入性治療手段等，并發癥較常見。馬爾尼菲籃狀菌是唯一一種雙相型青霉菌，微生物培養其菌落在28 ℃培養為玫瑰紅青霉樣，在37 ℃培養為酵母樣，正因其具有深部感染的致病力，且感染形式多為血流感染，所以形成菌血癥后可全身播散性傳播，病情發展迅速，病死率高。謝寧[9]報道顯示，97%的馬爾尼菲籃狀菌感染者為免疫功能缺陷的艾滋病人群，但在COVID-19并發尚屬首例,臨床治療首選兩性霉素B聯合使用伊曲康唑，有效率為77.3%[10]。

真菌(1-3)-β-D葡聚糖是真菌中細胞壁的多聚糖組分，如假絲酵母菌、曲霉菌、鐮刀菌等，是一種真菌廣譜循環標志物。GM是曲霉菌細胞壁的主要成分，其釋放量與菌量成正比，反應感染的程度。相關報道顯示，GM試驗對馬爾尼菲籃狀菌感染有一定的診斷價值[11]，與馬爾尼菲籃狀菌細胞壁有交叉反應。真菌(1-3)-β-D葡聚糖試驗結果跟真菌培養檢出酵母樣真菌的時間基本相符，GM試驗出現陽性的時間與馬爾尼菲籃狀菌培養出現時間相符。 hs-CRP是一種急性時相反應蛋白，可及時預測肺部的炎性反應狀態及損傷情況，其作用時激活補體，加強吞噬細胞吞噬病原微生物的功能，當血清水平快速升高時，就是病原微生物感染加重的表現。PCT是一種無激素活性的糖蛋白，由甲狀腺濾泡旁的C細胞分泌，當機體發生細菌感染時大量釋放入血液，但在病毒感染時無變化，可用于細菌性肺炎的鑒別[12-14]。但hs-CRP和PCT影響因素較多，腫瘤、組織損傷、自身免疫病等均會引起升高。在病情穩定期，hs-CRP檢測結果高于正常范圍的50倍左右，PCT檢測結果高于正常范圍的20倍左右,分別出現在COVID-19并發感染得到控制期和COVID-19陰轉后病情好轉期，hs-CRP的升高可能與患者肺部損傷短時期內未完全康復或已造成不可逆性損傷有關。而PCT的升高可能與嗜麥芽窄食單胞菌一直未清除有關；hs-CRP和PCT檢測的峰值出現時間一致，并與微生物學培養出白色假絲酵母菌和馬爾尼菲籃狀菌時間基本吻合，其峰值對出現新并發感染有提示作用。

通過觀察，真菌(1-3)-β-D葡聚糖、hs-CRP和PCT的峰值均出現在3月18日，為檢出近平滑假絲酵母菌前2 d，培養時間一般為3～4 d，考慮為感染引起。后面曲線均有所回落。3月29日真菌(1-3)-β-D葡聚糖有一次小高峰但并沒有引起hs-CRP和PCT的升高，考慮為患者自身免疫力的提高，可見在3月23日SARS-CoV-2陰轉后，酵母樣真菌定植，病情得到控制。從4月28日始，hs-CRP逐步上升而PCT沒有明顯變化，但到5月4日hs-CRP和PCT同時出現高峰，PCT檢測值升高了一倍并維持高水平，距離5月2日血液檢測出馬爾尼菲籃狀菌僅僅2 d時間，往前推5 d的送檢時間，4月28日即為馬爾尼菲籃狀菌血流感染期，hs-CRP上升明顯且迅速，PCT上升卻有所延后，而血清GM在5月4日的檢測值為0.37(陰性)，5月6日多部位標本檢出馬爾尼菲籃狀菌,GM檢測值>5.00(陽性)。由此可見，馬爾尼菲籃狀菌血流感染期到全身散播感染僅為10 d左右，病情兇險，發展迅速。hs-CRP和PCT第1次峰值(3月18日)上升幅度較高，可能與SARS-CoV-2未除，同時并發細菌和新發假絲酵母菌相關，第2次峰值(5月4日)上升幅度較第1次低，考慮SARS-CoV-2已除，但細菌和酵母樣真菌定植，新發馬爾尼菲籃狀菌感染引起；兩次升高中hs-CRP的幅度均較PCT高，這跟COVID-19引起肺部損傷引起hs-CRP基礎升高有關，而PCT的升高跟肺部損傷和病毒無關，只跟細菌或真菌等感染有關。本文研究對象是一位老年危重型COVID-19并發感染馬爾尼菲籃狀菌患者，抗菌藥物使用時間長達3個多月，頭孢類、培南類和萬古霉素類抗菌藥物的使用廣泛地抑制了大多數革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的生長。因此，并發感染對這幾類抗菌藥物耐藥的嗜麥芽窄食單胞菌，同時出現假絲酵母菌共同感染；卡泊芬凈和米泊芬凈是一種細胞毒作用藥物，多用于惡性腫瘤患者，可同時作用于病毒、細菌、真菌及人體正常細胞，一直用于COVID-19整個治療期間。由于嗜麥芽窄食單胞菌和白色假絲酵母菌均為條件致病菌，若患者免疫功能提高有可能自愈，故臨床一直致力于提升患者整體免疫力，未使用相應抗真菌藥物，同時有2個月的導管侵入性治療可能是馬爾尼菲籃狀菌潛伏生長，從而引起血流感染的原因。

總之，長期使用多種抗菌藥物、細胞毒類藥物治療COVID-19并發感染和侵入性器械治療是導致馬爾尼菲籃狀菌感染的原因，微生物檢查是“金標準”，聯合使用hs-CRP、PCT和GM檢測可提前預測馬爾尼菲籃狀菌散播性感染。因此,在治療COVID-19危重癥時，臨床若長期使用以上治療手段，建議在后期治療中加強微生物血培養、真菌(1-3)-β-D葡聚糖、hs-CRP、PCT和GM的檢測，同時及早使用兩性霉素B治療，防止COVID-19并發馬爾尼菲籃狀菌感染。