外泌體在甲狀腺癌診療中的研究進展

甲狀腺癌占所有惡性腫瘤的1%～5%，近年來，全世界人口不斷增加，人們生活水平迅速提高，甲狀腺癌發病率隨之上升，伴有淋巴結轉移的患者數量也在迅速增加[1]。根據美國癌癥中心發布的2020年腫瘤調查數據顯示，預計2020年女性甲狀腺癌新發人數在新發腫瘤總人數中的占比可上升至4%[2]。我國癌癥中心最新公布的2019年相關數據表明，2015年我國女性甲狀腺癌發病率高達8.49%，已成為女性人群第4大常見腫瘤。按照病理組織學分類，甲狀腺癌分為甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、甲狀腺髓樣癌(MTC)、甲狀腺濾泡狀腺癌(FTC)和甲狀腺未分化癌(ATC)。PTC是最常見的類型，約占85%，相對于其他病理類型，PTC的病灶可侵襲至甲狀腺以外的組織器官并可發生局部淋巴結轉移。研究顯示，約有1/3患者會發生術后復發轉移，且大部分于術后10年內發生。所以，必須長期隨訪甲狀腺癌患者，實時監測腫瘤的復發和轉移。

目前，主要通過超聲引導下細針穿刺細胞學檢查(FNAC)診斷甲狀腺癌，同時結合頸部超聲進一步明確是否存在淋巴結轉移。通過術前FNAC，仍有10%～30%甲狀腺結節性質無法明確，加之侵入性的有創穿刺檢查患者接受度普遍較低，臨床上的拓展、普及力度受限；科研工作中，由于FNAC獲取的樣本量偏少，難以滿足后續的研究需求，并且有限的樣本量檢測結果不能覆蓋異質性腫瘤的全貌。因此，針對臨床診療關注的難題和相關研究工作展開的需求，并基于對PTC發生、發展分子機制的認知，從PTC相關生物標志物的角度出發，有可能是解決PTC臨床早期診療難題和相關研究工作展開需求的關鍵。

外泌體來源于體內多種活細胞，其直徑30～150 nm，是具備穩定雙層質膜的囊泡，廣泛分布于各種體液中，并且攜帶有多種核酸、蛋白質、脂質等物質，是細胞間信息物質交流的重要載體[2-3]。癌細胞源性外泌體在甲狀腺癌的進程中發揮至關重要的作用。外泌體及其加工產物在甲狀腺癌的治療中也具有一定的應用潛能。近年來外泌體檢測在甲狀腺癌診療中的研究越來越多，其有可能成為較為理想的可供PTC臨床診療應用的生物標志物。

1 外泌體概述

PAN等[4]1983年首次在綿羊成熟的網織紅細胞中發現了一種外排的多形性囊泡樣小體。淋巴細胞、內皮細胞、成纖維細胞、間充質干細胞及腫瘤細胞等均可分泌外泌體，并且其幾乎存在于所有體液中，如血清、膽汁、腦脊液等[5-9]。生物信息學資料顯示，目前來自不同生物和細胞類型的外泌體含有41 860種蛋白質，1 164種脂類，4 946種mRNAs和2 838種miRNAs。細胞分泌的外泌體，被受體細胞通過胞飲或細胞的特異性受體等方式攝取，進而獲取其攜帶的生物信息，發揮細胞間通訊載體的作用。外泌體源性蛋白質及miRNA等核酸物質，可通過細胞間相互傳遞，參與信息交流，調控機體正常的生理過程，與多種炎性疾病、腫瘤的發生及進展有密切關系[3]。由于外泌體的細胞來源不同，其所攜帶的內容物信息量巨大，加之生物學功能的多樣化，近年來，外泌體在多種疾病發生、發展進程中所發揮的作用備受關注。

2 外泌體與甲狀腺癌

甲狀腺癌的具體發病機制尚處于探索階段，已經闡明的相關發病機制，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B(PI3K-AKT)途徑、基因突變、基因拷貝數目增加和基因發生甲基化等[10]。隨著外泌體生物學功能的進一步揭示和甲狀腺癌發生、發展分子機制研究的深入，外泌體與甲狀腺癌診療的相關研究成為近期醫學研究的熱點。

2.1外泌體調控甲狀腺癌的發生、發展 腫瘤微環境(TME)在惡性腫瘤的進展過程中發揮至關重要的作用。腫瘤細胞、炎性細胞、周圍基質細胞、細胞外基質等組分共同構成TEM。腫瘤細胞與TME的相互作用決定腫瘤的發生、發展、轉移和耐藥。腫瘤細胞源性外泌體參與構成TME，其含有豐富的miRNA，參與癌細胞與癌旁細胞的相互作用，從而促進TME的重塑。WU等[11]研究發現，在缺氧條件下甲狀腺癌細胞源性外泌體中miRNA-21-5p表達上調，miRNA-21-5p靶向性的抑制TGFBI蛋白和Ⅳ型膠原基因 COL4A1,從而促進內皮血管的形成。腫瘤生長、進展、侵襲對營養物質的需求量較大，腫瘤血管是其主要的供應來源。腫瘤細胞源性外泌體通過轉運血管生成相關的miRNAs和蛋白質等物質，促使腫瘤組織中微血管生成，同時明顯增加其通透性，從而調控腫瘤的發生和轉移。

外泌體miRNA通過不同機制在乳腺癌[12]、肺癌[13]、胃癌[14]的侵襲轉移中發揮重要作用，而其對甲狀腺癌侵襲進程的影響目前尚不完全明確。具有黏附性的上皮通過特定的轉化程序，轉變為能夠侵入細胞外基質的單個遷移細胞過程被稱為上皮間質轉化(EMT)[15]。研究顯示，EMT過程與腫瘤干細胞的生成及腫瘤發生遠處侵襲具有密切關系，腫瘤細胞發生EMT，導致腫瘤細胞間黏附作用明顯減退，遷徙能力顯著增強，從而促使腫瘤細胞發生遠端轉移[16]。有研究發現，甲狀腺干細胞外泌體可以通過轉移非編碼RNA(LncRNA)調控EMT，進而促進腫瘤干細胞(CSCs)產生，CSCs具有多種潛能，可以誘發腫瘤并誘導癌細胞對放療或化療抵抗，是惡性腫瘤復發、侵襲的關鍵機制[17]。同時，有研究指出，甲狀腺乳頭狀癌患者血清中miRNA423-5p表達上調，外泌體可能將miRNA423-5p導入癌細胞，進而加快癌細胞侵襲進程[18]。參與甲狀腺癌侵襲轉移的潛在標志物不僅局限于外泌體miRNA、LncRNA等核酸物質。LUO等[19]研究以發生淋巴結轉移為基準，將甲狀腺癌患者分為2組，采用液相色譜串聯質譜分析技術，比較其血清外泌體蛋白質表達譜，結果發現697個差異表達蛋白，其中SRC、TLN1、ITGB2、CAPNS1等蛋白呈過表達，與甲狀腺癌細胞的轉移有明確關聯。馬艷梅等[20]研究發現，PTC患者外泌體中晚期糖基化終末產物受體RAGE可通過激活Wnt/β-catenin信號通路，以上調Vimentin和下調E-cadherin的模式，促使細胞發生EMT，進而加強惡性腫瘤遠處浸潤遷徙的能力。此外，劉靜等[21]研究提取甲狀腺切除術后引流液中的外泌體，完善蛋白標記識別和細胞外囊泡鑒定，從而證明術后引流液中富含外泌體顆粒，同時繪制結節性甲狀腺腫和PTC差異表達外泌體miRNA聚類熱圖，研究提示術后引流液中外泌體miRNA表達譜存在明顯差異，hsa-miRNA-609的表達差異最明顯，進一步生物信息分析顯示，外泌體hsa-miRNA-609靶基因與PTC的發生緊密相關。以上研究均說明，在甲狀腺癌的病程中，外泌體miRNA、LncRNA和蛋白質等表達譜存在顯著差異，差異表達的物質在腫瘤的發生、發展、轉移和耐藥過程中可能發揮重要作用。

2.2外泌體在甲狀腺癌篩查診斷中的研究進展 目前，甲狀腺癌的診斷主要依靠FNAC技術。資料顯示，10%～30%的甲狀腺結節通過FNAC無法明確其性質，部分患者可能遭受非必須的甲狀腺切除，并需要終身服藥治療。加之對侵入性的穿刺檢查方法患者接受度較低，臨床上的推廣應用效果欠佳。近年來，臨床檢驗診斷學技術、方法日新月異，各種組織或器官特異性腫瘤生物標志物不斷涌現，有力地推動了腫瘤診斷學科水平的提升。外泌體含有多種細胞來源的特征性核酸、蛋白等物質，通過檢測外泌體內相關特征性物質，可能為甲狀腺癌的協助診斷、靶向治療、預后評估提供實驗參考依據及新的研究方向[22]。作為腫瘤診治過程潛在理想的標志物，外泌體具有以下優勢：(1)分布廣泛，取材方便；(2)具有磷脂雙層膜結構，性狀穩定；(3)納米尺寸避免被單核吞噬系統吞噬；(4)內容物來自母源細胞，具有細胞特異性。有研究顯示，甲狀腺癌患者的外泌體miRNA譜較健康人群有特異性的改變，miRNA-31、miRNA-21在PTC患者血清外泌體中表達顯著上調，其中miRNA-21可用于良性結節和PTC的鑒別診斷[21]。DAI等[23]研究指出,血清外泌體miRNA-485-3p和miRNA-4433a-5p可作為PTC的臨床檢驗診斷指標，miRNA-485-3p可評估腫瘤分化的風險性。LEE等[24]研究顯示，miRNA-146b和miRNA-222在甲狀腺癌細胞外泌體中顯著上調。PAN等[25]繪制了PTC和結節性甲狀腺腫血漿外泌體miRNAs差異表達譜,其中miRNA-5189-3p、miRNA-3163等在PTC患者血漿外泌體中顯著上調。因此，差異表達外泌體miRNA可用于甲狀腺惡性腫瘤和結節性甲狀腺腫塊的鑒別診斷。

甲狀腺癌診斷的潛在標志物不僅局限于外泌體源性的miRNA，YANG等[26]研究篩選出PTC和良性甲狀腺腫患者22個差異表達的環狀RNA，其中3個在PTC患者血清中上調，19個下調，進一步完善基因富集分析，結果提示上述差異表達的基因與16條信號通路有關，包括甲狀腺激素信號通路、AMPK信號通路，為深入闡明甲狀腺癌的具體發病機制提供了全新的切入點。此外，有研究指出，尿液中外泌體甲狀腺球蛋白是監測甲狀腺癌復發的理想生物標志物[27]。上述研究均說明，甲狀腺癌源性外泌體中的miRNA、環狀RNA、蛋白質等物質可能是甲狀腺癌早期診斷、預后評估和復發監測的潛在生物標志物。目前，外泌體在應用過程中仍有很多問題，如尚未明確高效統一的外泌體提取純化及鑒定方法，缺氧、炎癥、腫瘤、應激等機體狀態可影響外泌體的動態改變。因此，外泌體在甲狀腺癌篩查診斷中的臨床應用尚需進一步研究和探索。

2.3外泌體在甲狀腺癌治療中的研究進展 腫瘤細胞分泌的外泌體參與TME的構成，而TME的重塑可促進腫瘤的發生、發展。因此，干預腫瘤外泌體的釋放和轉移，有可能開啟一種全新的腫瘤治療模式。WU等[11]研究顯示，通過抑制PTC外泌體miRNA-21-5p，可減少其介導的腫瘤血管生成。同期的另一項研究也證實，PTC細胞外泌體中miRNA423-5p沉默可抑制PTC細胞的遠處侵襲能力[18]。ZHANG等[28]通過體外細胞實驗和反轉錄聚合酶鏈反應證實，miRNA-145可通過直接抑制RAB5C蛋白表達，進而阻礙腫瘤的遷移，誘導細胞凋亡過程。因此，miRNA-145和RAB5C可能是PTC的潛在治療靶點。

以外泌體作為靶向載體，輸送外源性藥物用于腫瘤治療也是近年來研究的一個熱點。基于外泌體的納米尺寸范圍(30～150 nm)，設計可供其攜帶的納米級藥物，可避免被單核吞噬系統吞噬，且易于通過腫瘤周圍的高滲透性血管，進而將藥物安全、有效地運到腫瘤組織。此種以外泌體為載體的給藥方式，具有獨特的生物相容性、低免疫原性、高穩定性等特點。目前，有關外泌體作為載體，靶向輸送外源性藥物的研究比較多。通過超速離心、聚乙二醇沉淀、磁珠吸附、免疫親和捕獲等分離純化方法可獲取高純度外泌體；采用超高分辨電子顯微鏡評估其結構大小及表面分子，繼而輔予：(1)質譜、Western blot和酶聯免疫吸附試驗進行蛋白分析；(2)2代測序和PCR技術進行RNA分析，進而評估優化外泌體。在藥物與載體嵌合層面,主要通過直接混合、孵育、超聲、渦流、電穿孔、轉染等方法，將外源性藥物或分子裝載到外泌體進而輸送至靶細胞發揮作用。以上外泌體分離提取、分析評估和藥物裝載輸送的流程完善詳盡，但是此種藥物轉載輸送方式是否會破壞外泌體囊泡的完整性、穩定性及是否會影響其生物學功能，目前尚不清楚[29]。SANCHO-ALBERO等[30]研究發現，常規抗癌藥物缺乏細胞特異性，是導致腫瘤患者化療期間產生各種不良反應的主要原因。KIBRIA等[29]將鈀催化劑通過外泌體直接轉送至腫瘤細胞的內部，催化劑可將非活性抗癌藥物帕比司他轉化為有活性的形式，使腫瘤細胞自身內部瓦解而不破壞周圍正常組織。有研究證實，巨噬細胞源性的外泌體裝載小分子化學治療藥物如紫杉醇，可在肺癌轉移部位富集藥物，并有很好的治療效果[31]。以上研究提示，外泌體可作為一種靶向治療工具用于甲狀腺癌的治療，雖需大量動物實驗和臨床研究進一步驗證其在臨床診療過程中的應用價值，但不可否認這是未來研究的新方向。

3 展 望

外泌體的相關研究為甲狀腺癌的早期診療帶來新的思路和廣闊的應用前景，但目前尚有諸多因素影響和制約其在臨床的普及。一方面，尚未明確統一的外泌體提取、純化及鑒定方法，現行的方法，如差速離心法、磁珠吸附法、聚乙二醇沉淀法、免疫親和法等，難以確保所提取囊泡的純度。另一方面，雖然國內外有關外泌體在甲狀腺癌診療中的研究報道，內涵豐富、切入點明確，但受限于諸多因素，實驗設計不盡完善，如僅對外泌體所包含物質進行初步的生物信息學分析，發現差異表達miRNA、環狀RNA等物質，而對目標物質缺乏深入研究，而且相關研究成果缺乏大規模的臨床應用和循證醫學驗證。既往的經驗表明，樣本量較小的實驗發現的候選標志物，需要通過大量的人群樣本進行驗證，從而證實其可靠性。此外，目前外泌體與甲狀腺癌的相關研究主要局限于miRNA等核酸物質，外泌體含有的特征性蛋白與甲狀腺癌發生、發展的關聯性尚需進一步挖掘和明確。