量子點作為熒光標記物在臨床檢測方面的應用研究進展

夏成靜 綜述，周小合 審校

中國科學院大學深圳醫院(光明)，廣東深圳 518106

v

量子點作為一種極具應用前景的信號標記,與傳統有機熒光染料相比,具有寬而有效的激發譜,窄而對稱的發射譜,高的熒光量子效率,優異的光化學穩定性,方便、靈活的表面可修飾性,且不同尺寸量子點可以被同一波長的光激發，發射不同波長的熒光等獨特的光學特性[1-2]，在生物分析中的應用日益廣泛，尤其有望在多重檢測方面發揮重要的作用。

1995 年ALIVISATOS和NIE兩個小組幾乎同時在《Science》上分別發表了量子點應用于不同生物體系實現量子點熒光標記的開創性工作,此后,關于量子點在生物領域應用研究工作的報道越來越多。

1 量子點熒光標記的基本原理

量子點即半導體納米粒子或納米晶,是指半徑小于或接近于激子玻爾半徑的半導體納米晶粒。它們多由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素組成,性質穩定,直徑在1～100 nm,這一微小的粒徑導致了電子及空穴被量子限域,從而使分離的能級結構取代原來連續的能帶,因此具備了一些類似大分子多環芳香烴的光學特性,即由高能量激發導致能級躍遷而產生熒光，而量子點同時具有傳統熒光染料沒有的多種物理和光學特性，在熒光標記領域正發揮著卓越的優勢。

2 量子點在核酸檢測方面的應用

以偶聯上量子點的核酸作為探針，可以與目標物的核酸相雜交，通過檢測量子點的熒光量來對目標物進行定量，靈敏度較普通熒光顯色檢測法更高，顯示出卓越的標記特性。 楊向榮[3]利用Cd S/ZnS量子點標記能與肺癌腫瘤標志物miR-21互補的核酸結合，再利用磁珠核酸探針與miR-21配對，然后利用磁分離手段將磁珠從檢測體系中分離，部分量子點探針因未捕獲到miR-21而遺留在上清液中，通過檢測上清溶前后的量子點熒光信號的強弱，實現對肺癌標志物miR-21的定性和定量檢測，檢測下限可達1 fmol/L，線性范圍涵蓋1 fmol/L～10 pmol/L，且具有較高的檢測特異性。 GLIDDON等[4]利用熒光偏振技術通過QD525和 QD655同時檢測結核桿菌GBP6 和TMCC1基因，實現了基于量子點光學特性的多重檢測。LEE等[5]報道了基于535、575、620這3種激發熒光譜的量子點標記核苷酸檢測尿中3種前列腺癌融合基因，獲得了很好的線性范圍和1 fmol/L的檢測限，整個檢測60 min內完成，證明了量子點用于核酸多重檢測的優良特性。

3 量子點在蛋白檢測方面的應用

量子點與核酸結合成為了基因研究的新寵，并且獲得了非常滿意的效果，但都需要首先對標本進行PCR擴增，才能達到檢測效果。與傳統熒光標記物相比，如果利用量子點靈敏度更高的特性，標記抗體蛋白，就可以不需要擴增步驟，在病程早期更快速地獲得檢測結果。吳思敏[6]制備了高熒光性的量子點肺癌腫瘤標志物癌胚抗原(CEA)的高靈敏檢測探針，檢測探針和磁珠結合的捕獲探針與CEA發生免疫反應形成三明治結構，利用磁力分離器對免疫復合物進行富集后，通過檢測富集在磁珠表面的量子點熒光信號，實現對CEA定量檢測的目的，該方法的檢測靈敏度為38 pg/mL,較傳統酶聯免疫方法提高了約40倍，同時為實現對多種腫瘤標志物的同步檢測，作者在建立高靈敏度單指標檢測方法的基礎上，實現了對肺癌腫瘤標志物CEA、細胞角蛋白19片段(CYPFA21-1)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)的同步檢測，篩選出3種不同發射波長的量子點，即QD525、QD585、QD625，分別對NSE、CEA和CYPFA21-1單克隆抗體進行標記，待免疫反應完成后，通過熒光成像分析方法對富集在磁珠表面的量子點熒光信號的種類和強度進行直接讀取，實現對多靶標抗原的定性與定量檢測，該方法不僅靈敏度和檢測范圍滿足臨床需求，而且能夠有效地節省時間、樣品量和成本。MONTORO BUSTOS等[7]在質譜法中用量子點作為標記物標記Ab2抗體,不僅避免了量子點與不同的靶抗體進行復雜的交聯，而且可以利用量子點的元素特性在質譜儀中進行多重檢測和質量控制，靈敏度也遠遠高于ELISA等光譜測定方法，轉鐵蛋白的檢測限可以達到0.23 fmol/L。

4 量子點與流式平臺結合的應用

量子點以優于傳統熒光標記物的特性用于核酸和蛋白質的多重及高靈敏檢測已獲得業界的肯定，但檢測平臺的不足限制了它在多重性檢測方面的優勢。胡曉璐等[8-11]采用量子點流式微球技術，在流式細胞儀上根據散射光檢測攜帶特異性抗體的微球以確定檢測物質，以量子點熒光強度確定檢測物質的量，分別檢測了曲霉菌半乳甘露聚糖、胰島素抗體、降鈣素原和胃癌相關抗原 MG7，并對精密度、線性范圍、靈敏度進行評價，都優于傳統的檢測方法，并展望了利用不同大小免疫微球和不同粒徑量子點結合用于多重檢測的可能性。 CABRAL FILHO等[12]在流式細胞儀上用530 nm和580 nm的量子點標記血型抗體檢測紅細胞上的多種血型抗原，不論是靈敏度還是特異度都獲得了滿意的效果。BRAZHNIK等[13]建立了利用發射不同熒光譜的量子點微球標記不同的抗體，在流式細胞儀上多重檢測前列腺癌特異抗原，與ELISA相比,無論是速度、成本，還是檢測限都有巨大的優勢。BILAN等[14]用3種不同尺寸由量子點組裝成的微球分別標記3種肺癌特異性抗原，在流式細胞儀上對肺泡灌洗液進行檢測，與傳統的Luminex xMAP系統比較獲得很好的相關性。

由于量子點的優異光學特性，越來越多的學者利用量子點帶來的高靈敏度，結合流式檢測平臺用于許多豐度較低的物質檢測。 LIN等[15]將CuInS2/ZnS 量子點與Fe3O4復合成多聚微球，微球與抗FcεRIa單克隆抗體偶聯后在流式細胞儀上檢測血清中的FcεRIa，發現SLE患者與健康人有明顯差異，檢測限可達到0.29 ng/mL。SHANDILYA等[16]用量子點偶聯的蛋白探針微球在流式細胞儀上檢測與AGO2蛋白結合的胞外miRNAs，也獲得了很好的靈敏度和特異度。同時，蔡冰潔等[17]建立了一種量子點的流式微球技術，用于高通量的DNA檢測，將能與靶DNA一端雜交的探針DNA(P1)標記在微球表面，與DNA配對雜交后，加入能與靶DNA另一端雜交的量子點標記的探針DNA(P2)，組裝成一種流式微球-探針P1、靶DNA、量子點-探針P2的夾心復合結構，通過測定雜交前后平均熒光強度的變化檢測DNA的濃度，該新型檢測方法可以區分出完全互補、單堿基錯配及完全非互補的DNA。

5 量子點多重檢測的展望

量子點代替傳統熒光物質與流式微球技術結合既可以發揮量子點靈敏度高和熒光穩定性強的特點[18]，也可由它寬而有效的激發譜、窄而對稱的發射譜、熒光發射譜隨粒徑大小可調、且可以做到互不干擾的特性使它與不同大小微球進行組合在流式平臺上進行檢測，可以滿足臨床多重檢測的需要。目前不同顏色的量子點也可以滲入到微球內部或組裝成微球成為編碼微球，根據量子點的熒光顏色和強度用于多種物質的同時檢測[19-20]，但量子點的泄漏和工藝仍然是國內阻礙量子點編碼微球在多重檢測方面的重要因素,但隨著傳統熒光染料在Luminex及流式平臺上多重檢測的限制，比如熒光譜的重疊補償和熒光激發器需要量的增加，使具有多重編碼優勢的量子點微球逐漸替代傳統熒光染料成為現實[21-22]。

量子點作為一種極具應用前景的信號標記,雖然現在臨床只用于一些炎癥指標等的單重免疫檢測，在多重檢測和流式方面的應用還只是停留在實驗室研究階段，它的最佳熒光發射需要紫外光的激發阻礙了其與其他檢測平臺的結合和限制了它的應用。但隨著流式細胞儀激發光選擇性的增加(最先進的流式細胞儀已可提供405 nm的激發波長)，以及為了適應量子點的多重檢測，新的檢測儀器可能被開發出來，可以為量子點的激發提供紫外附近的光源，如果和流式微球技術相結合使得量子點成為臨床最受歡迎的多重熒光標記物成為可能，使其成為多重、高通量、高靈敏的標記物逐漸成為現實。