分子診斷在甲狀腺結節診斷中的應用和進展

夏 葦 綜述，張玉洪 審校

重慶醫科大學附屬第一醫院檢驗科，重慶 400016

近年來，甲狀腺癌的發病率明顯增加，已成為發病率增加速度最快的惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤中排名第4[1]。甲狀腺癌有4種病理類型：甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、甲狀腺濾泡癌(二者合稱分化型甲狀腺癌)、甲狀腺髓樣癌以及甲狀腺未分化癌，其中PTC最常見。PTC的總體病死率較其他惡性腫瘤低，預后較好，但部分患者接受了手術和放射性碘治療后仍出現復發和轉移。雖然超聲、細針穿刺細胞學(FNAC)診斷等檢查手段使大部分甲狀腺結節得到明確診斷，但仍有部分患者存在漏診或過度治療的情況。隨著基因組、蛋白質組等組學技術和醫學前沿技術用于腫瘤的病因和治療靶點的研究，多種分子標志物被分析鑒定與應用。利用分子診斷技術對腫瘤進行分子分型和個體化用藥指導顯得非常重要。本文就甲狀腺結節細針穿刺進行細胞學診斷的同時利用分子診斷技術對相關基因檢測進行綜述，目的是更深層次地理解各項分子診斷技術的優缺點，指導臨床選擇最合適的分子診斷試驗，以達到臨床效益的最大化。

1 甲狀腺細胞學診斷的局限性

隨著醫療水平的發展，越來越多的甲狀腺結節被檢出，大部分甲狀腺結節為良性病變，僅少數為惡性。甲狀腺FNAC是術前鑒別結節良惡性結節最經典的方法。該技術是在超聲引導下，將細針穿刺進病變組織，利用負壓吸引出細胞，將吸引物涂片染色后在顯微鏡下觀察細胞形態，根據Bethesda報告系統進行細胞學診斷。Bethesda報告系統共包含6個類別：Ⅰ，標本無法診斷或取材不滿意；Ⅱ，良性病變；Ⅲ，意義不明確的細胞非典型病變,或意義不明確的濾泡性病變(AUS/FLUS)；Ⅳ，濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤 (如為許特爾細胞型需備注)(FN/SFN)；V，可疑惡性(SM)；Ⅵ，惡性[2]。其中AUS/FLUS、FN/SFN和SM這3種類別為細胞學診斷不確定的結節。由于最新的2017版甲狀腺細胞病理學Bethesda報告系統增加了具有乳頭狀核特征的非浸潤性甲狀腺濾泡性腫瘤(NIFTP)的診斷，并且不再將其判定為甲狀腺癌，則修改后的AUS/FLUS、FN/SFN和SM結節的惡性風險分別為6%～18%、10%～40%和45%～60%[2]。盡管Bethesda報告系統的推廣使得甲狀腺細胞學診斷的定義更加規范，但各個機構給出的6個類別的惡性風險存在差異，且細胞病理醫師的經驗不同，診斷一致率僅70%左右，因此仍有約10%～40%的結節無法獲得明確的良惡性診斷[3]。分子診斷的出現有助于明確甲狀腺結節的診斷，指導臨床管理，從而避免不必要的手術。

2 甲狀腺癌的分子標志物

2.1BRAF基因 BRAF基因即鼠類肉瘤濾過性病毒致癌同源體B1，是位于人類第7號染色體長臂的原癌基因，是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)RAS-RAF-MEK-ERK信號通路的一環，編碼的BRAF蛋白屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，在細胞生長、分化和凋亡方面有重要作用[4]。BRAF基因有多種突變類型，其中最常見的是V600E突變，即第1799位置的胸腺嘧啶突變為腺嘌呤，從而使第600位密碼子編碼的纈氨酸轉變為谷氨酸；BRAF V600E突變導致BRAF激酶形成活性構象，持續激活MAPK通路的下游信號分子，同時抑制抑癌基因的作用，導致細胞不斷分裂、增殖形成腫瘤細胞[5]。有文獻報道BRAF V600E突變可增加基因組的不穩定性，引起TSH信號通路激活，從而使細胞更具有侵襲性[6]。BRAF V600E突變還可以導致鈉碘同向轉運體啟動子的組蛋白去乙酰化，使鈉碘同向轉運體基因沉默，導致PTC患者富集碘能力減弱，對131I治療的敏感性降低[7]。

BRAF V600E是PTC中最常見的分子改變，對于PTC具有高度特異性，存在于36%～80%的乳頭狀癌中，研究表明其不存在于甲狀腺濾泡癌、髓樣癌和良性病變中[8]。最新版的Bethesda報告系統中建議對于細胞學無法診斷的病例可進行分子診斷[2]。有研究發現中國PTC患者的BRAF V600E突變率高達87.7%，BRAF V600E診斷乳頭狀癌的特異度和陽性預測值均高達100%[9]。鑒于BRAF V600E突變對于PTC的高度特異性，許多學者認為一旦存在BRAF V600E突變，幾乎就可以診斷為PTC[10-11]。一項包含88個研究的Meta分析顯示，聯合FNAC和BRAF V600E突變檢測可將靈敏度由81.4%提高至87.4%，假陰性率由8%降至5.2%；進一步分析顯示，BRAF V600E突變檢測的診斷價值在不同細胞學診斷不確定分類中的價值不同，BRAF V600E突變檢測在SM和AUS/FLUS結節的靈敏度(59.4%和40.1%)明顯高于FN/SFN結節(19.5%)，ROC曲線分析也證實BRAF V600E突變檢測在SM和AUS/FLUS結節中的診斷價值更高[11]。

BRAF V600E蛋白激酶具有促進細胞增殖、生長和分裂的功能，因而受到廣泛關注，大量研究探討BRAF V600E突變與各項臨床病理特征的關系。體外試驗顯示出BRAF V600E突變與PTC侵襲性特征高度一致的結果，而臨床試驗呈現出截然相反的結果，使得BRAF V600E突變能否作為PTC的侵襲性標志物仍有爭議。大多數研究認為BRAF V600E突變與更差的臨床病理特征有關，如淋巴結轉移、遠處轉移、更差的腫瘤分期、侵襲性亞型、腫瘤大小、男性、老年等有關，因此推薦在甲狀腺全切術基礎上進行中心淋巴結清掃，同時術后予以更嚴格的放射性碘治療和密切的隨訪[12]。然而一些研究未發現存在上述關聯[13]。這些研究存在差異可能是由研究納入的樣本量、患者的流行病學特征、乳頭狀癌亞型、用于分子檢測的標本種類和檢測方法等不同造成的。

2.2RAS基因 RAS基因包括3種類型(HRAS、NRAS、KRAS),其通過調節MAPK和PI3K-AKT通路從而調控細胞增殖、分化。RAS基因突變是甲狀腺結節中第2常見的分子改變，可發生在多種類型的甲狀腺腫瘤中，包括甲狀腺腺瘤、甲狀腺濾泡癌、PTC、濾泡變異性PTC和甲狀腺未分化癌等。研究顯示RAS突變在分化較差的甲狀腺癌和甲狀腺未分化癌中的發生頻率更高，表明其更傾向于和腫瘤的進展而不是腫瘤的起源有關[14]。在PTC中，RAS基因突變很少與BRAF突變同時存在，顯示出其具有獨立的促進乳頭狀癌發生、發展的作用[15]。由于甲狀腺濾泡癌的診斷條件必須包括包膜和(或)血管侵犯，僅憑FNAC診斷很難做出明確診斷。有研究發現，甲狀腺濾泡癌和濾泡變異性PTC中RAS基因突變的頻率要高于BRAF基因突變，因此聯合RAS和BRAF基因突變檢測有助于提高甲狀腺濾泡癌和濾泡變異性PTC的檢出率[16]。部分RAS基因突變的甲狀腺結節經術后病理證實為甲狀腺腺瘤，從而增加了RAS基因突變假陽性的概率，但研究表明攜帶有RAS基因突變的甲狀腺腺瘤患者后期易發展為分化較差和更具侵襲性病理特征的甲狀腺癌。一項Meta分析顯示在診斷不明確的甲狀腺結節中，RAS基因突變檢測的特異度和陽性預測值分別為93.5%和78%[17]。

2.3RET/PTC基因重排 RET基因是一種原癌基因，編碼的RET蛋白為酪氨酸蛋白激酶受體；RET蛋白主要在甲狀腺濾泡旁細胞或C細胞中表達，而在甲狀腺濾泡細胞中是否表達仍有爭議[18]。RET基因可與多種異源基因發生融合，產生至少13種不同的RET/PTC重排類型，從而激活RAS-RAF-MAPK信號通路，導致細胞不斷增殖、分化，形成腫瘤細胞[18]。RET/PTC重排最常見的類型為RET/PTC1和RET/PTC3，二者占比達90%以上。研究表明，RET/PTC重排在兒童患者和有放射性物質接觸史的患者中發生頻率較高[19]。放射性物質可導致DNA雙鏈斷裂，增加DNA結構的不穩定性，從而有利于RET基因和其他非相關基因發生基因重排[20]。

2.4PAX8/PPARγ基因重排 PAX8/PPARγ在甲狀腺癌中的發生頻率較低，單獨出現PAX8/PPARγ重排對甲狀腺癌的診斷價值有限，但其對甲狀腺癌的包膜侵犯和血管浸潤有一定的提示意義。關于PAX8/PPARγ的研究數據較少，一項Meta分析顯示11項研究中共有20個結節存在PAX8/PPARγ，PAX8/PPARγ的陽性預測值為55%[21]。

3 甲狀腺分子診斷技術的進展

3.17種基因聯合檢測 約70%的甲狀腺癌可出現以下至少一種分子改變：BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、RET/PTC1、RET/PTC3和PAX8/PPARγ[10]。聯合檢測這7種分子標志物有助于提高細針穿刺抽吸(FNA)的特異度和陽性預測值,從而輔助診斷甲狀腺癌。但其靈敏度不夠，未檢測到突變不能排除甲狀腺癌。NIKIFOROV等[10]在細胞學診斷不明確的甲狀腺結節中檢測了以上7種分子標志物，結果顯示在AUS/FLUS、SFN/FN結節和SM結節中的靈敏度分別是63%、57%和68%，特異度分別是99%、97%和96%。在AUS/FLUS、SFN/FN、SM結節中檢出任何一種突變提示惡性風險分別高達88%、87%、95%，然而未檢出突變仍然提示AUS/FLUS、SFN/FN、SM結節分別存在5.9%、14%、28%的惡性風險。2015年的美國甲狀腺學會(ATA)指南出版之前，臨床上對7種基因試驗陽性者建議直接進行甲狀腺全切術，而不是葉切除術，可減少診斷性葉切除術后證實為惡性者進行二次手術的概率。而2015年的ATA指南推薦小于4 cm的甲狀腺癌即使7種基因試驗檢出任何突變，仍可進行葉切除術，這進一步減弱了7種基因試驗在臨床手術決策中的作用。

3.2Afirma基因表達分類器(GEC) 根據美國國家癌癥研究所提出的評估診斷檢測方法的指南，一種好的檢測方法應該將95%的病例排除在癌癥之外。細胞學診斷結果為良性的陰性預測值高達97%，理想的分子診斷測試也應達到這一標準。Afirma GEC使用微陣列芯片技術測試了167種基因的mRNA表達活性，包括了用于鑒別良性(Afirma GEC結果為陰性)和可疑惡性(Afirma GEC結果為陽性)結節的142種基因以及用于篩選罕見腫瘤(如轉移性甲狀腺癌、甲狀腺髓樣癌、嗜酸性腫瘤等)的25種基因。ALEXANDER等[22]開展了一項大樣本、多中心、前瞻性的研究，結果顯示通過Afirma GEC檢測基因的表達能降低超過一半以上不必要的甲狀腺癌手術率。良性的Afirma GEC結果在細胞學診斷不明確的結節中的靈敏度和陰性預測值分別是92%和93%。該研究表明Afirma GEC基因表達檢測結果為良性的預測準確性與細胞病理學檢查為良性結果的預測準確性是相似的，但其特異度和陽性預測值僅為52%和47%，無法正確地識別出惡性病灶。

雖然已有多項研究證實了Afirma GEC在降低不必要的甲狀腺癌手術率方面的價值，但仍有部分研究質疑Afirma GEC在臨床實踐中的效益。針對細胞學診斷為許特爾細胞型的甲狀腺結節，研究顯示Afirma GEC的特異度降低，假陽性率增加，限制了其在這一特殊類型結節中的應用。BRAUNER等[23]進行的研究顯示，43例Afirma GEC結果為可疑惡性的許特爾細胞型患者進行了手術，術后僅6例患者為惡性，即86%(37/43)的患者進行了不必要的手術。有研究發現使用Afirma GEC并沒有明顯地改變臨床手術的決策，僅8.4%(23/273)的患者根據Afirma GEC的結果改變了臨床治療方案[24]。不同的研究結論存在差異可能是由于各個機構的甲狀腺結節惡性率、貝塞斯達系統各分類占比、許特爾細胞型占比、隨訪時間等不同所致。

3.3ThyroSeq 隨著癌癥基因組圖譜的繪制及高通量測序(NGS)技術的發展，7種基因聯合檢測和Afirma GEC的局限性將被逐漸克服。2014年，表現優異的基于NGS技術的ThyroSeq v2測定板被應用于FN/SFN結節，其可檢測15種點突變和42種基因融合，結果顯示ThyroSeq v2的靈敏度和特異度可達90%和93%，陽性預測值和陰性預測值分別為83%和96%[25]。之后又評估了ThyroSeq v2在AUS/FLUS結節中的診斷價值，靈敏度和特異度分別為90.9%和92.1%，陽性預測值和陰性預測值分別為76.9%和97.2%[26]。ThyroSeq v2同時有著較高的靈敏度和特異度。最新版的ThyroSeq v3將檢測基因數增加至112，包括5種分子改變形式：點突變、插入/缺失、基因融合、拷貝數改變和異常基因表達，將其應用于FNA標本中得到的靈敏度為98.0%,特異度為81.8%,正確度為90.9%[27]。隨著ThyroSeq版本中檢測基因數量的增加，該試驗的靈敏度也逐漸提高，顯示出更高的臨床應用價值。

4 分子診斷面臨的挑戰

4.1帶乳頭狀細胞核特征的非侵襲性濾泡型甲狀腺腫瘤(NIFTP)概念的提出 2015年，NIKIFOROV等人提出了NIFTP這一新的組織病理學診斷，其原來被稱為非浸潤性包裹性濾泡亞型PTC，NIFTP不再被認為是甲狀腺癌，而僅具有極低度惡性潛能。NIFTP與濾泡亞型乳頭狀癌最主要的區別點是NIFTP不具有血管或包膜侵犯，主要診斷標準還包括包裹性或界限清楚、濾泡生長模式和乳頭狀癌的核特征等。按照新的診斷標準，43.5%的濾泡亞型乳頭狀癌和4.4%的乳頭狀癌現在應該被診斷為NIFTP，導致了術后惡性率的降低[28]。一項研究分析了增加NIFTP診斷對甲狀腺細胞病理學Bethesda報告系統各個類別惡性率的影響，結果顯示AUS/FLUS、FN/SFN結節和SM結節的術后惡性率降低最明顯，分別降低了20%、30.8%和31.9%[29]。本綜述中的部分研究發生在NIFTP診斷提出之前，因此，我們需要對上述分子檢測的實際用途保持謹慎，未來需要更多包含NIFTP類別的研究，校準分子檢測的診斷價值。

4.2分子標志物與病理的關系 分子標志物陰陽性與術后病理良惡性之間的關系并不精確。BRAF V600E突變是PTC中最特異的指標，其在良性病變中不存在，但不是所有的乳頭狀癌均攜帶BRAF V600E突變，未檢出BRAF V600E突變不能排除乳頭狀癌。而RAS突變、RET/PTC、PAX8/PPARγ在良性病變中的概率分別達48%、68%、55%[30]。因此良性病變可以攜帶突變，惡性病變可以不攜帶突變。在967個細胞學診斷不確定的甲狀腺結節中，檢出任一突變的惡性率為89%，而未檢出任何突變的惡性率仍有11%。因此目前的分子檢測試驗的診斷價值仍未達到理想標準，需要進一步提升分子檢測技術的檢測性能。

4.3隨訪時間 部分研究中分子檢測結果為陰性的病例沒有進行手術獲得術后病理結果這一金標準，僅憑長期隨訪就確定為良性，當隨訪時間沒有達到足夠長時，可能會將患者誤分類為良性，因此需要多中心、大樣本、長期的前瞻性研究隨訪細胞學不確定、分子檢測呈陰性的結節的性質以期更客觀地評價分子檢測的診斷價值。

4.4標本采集和轉運 大部分分子檢測試驗需要進行額外細針穿刺獲取專門用于分子檢測的穿刺液標本，并且需要保存在專用的細胞保存液中。已有研究探討了使用穿刺針殘留物標本進行分子檢測的可行性，未來將朝著低樣本量、高通量方向逐漸發展。分子檢測試驗存儲和轉運的要求也較普通檢驗項目更為嚴格，如有偏差可能會影響試驗結果。由于大部分分子檢測試驗僅在大型醫療機構及發達地區開展，這無疑增加了標本轉運時間及報告發布周期。未來分子檢測試驗的普及將克服這些挑戰。

5 小結與展望

細胞學診斷不確定的病灶是甲狀腺結節診斷中的最大難點。盡管這部分結節大多數術后為良性，但單獨依靠細胞形態學通常難以診斷。分子診斷的出現可以提供更多的危險分層信息，以指導臨床決策。分子標志物的分析不僅僅可用于診斷，其在預后及治療方面的作用也日益顯著，可為放射性碘治療和全身治療提供信息。進一步了解導致甲狀腺癌的分子突變，可能有助于開發針對高危患者的新藥，改變攜帶特定突變患者的治療方法，更有針對性地進行危險分層和預后討論。

甲狀腺癌病理診斷和分子診斷面臨的挑戰和機遇正變得越來越明顯。與此同時，精準醫療是臨床應用的發展趨勢，其需要準確度高和快速的測試，從而有效地消除傳統醫學的反復試驗和錯誤。同時，臨床醫師、病理醫師和檢驗醫師應知道，任何試驗都存在優勢和不足。對于不確定的甲狀腺結節，必須綜合考慮所有臨床資料和實驗室結果才能做出最終決策。